小鼠骨髓细胞染色体标本的制备.pdfVIP

小 鼠 骨 髓 细 胞 染 色 体 标 本 的 制 备 【目的要求】 1. 掌握小鼠细胞染色体标本制备方法。 2. 计数并观察小鼠骨髓细胞分裂中期染色体的数目及特点 【基本原理】 在骨髓细胞中，有丝分裂旺盛，因此不需要体外培养就可以直接得到中期细胞。 骨髓细胞具有高度的分裂活性，经秋水仙素或秋水酰胺处理后，使分裂细胞阻断 在有丝分裂中期，再经低渗处理、固定、滴片、染色等步骤，可制作较好的骨髓 细胞的染色体标本。 【实验用品】 1．器材：解剖刀、剪刀、镊子、注射器、离心机、离心管、恒温水浴箱、冰冷载 玻片、酒精灯、大培养皿、显微镜、纱布 , 标签纸，记号笔等； 2 ．试剂 0.1% 秋水仙素溶液、 Carnoy’s 固定液（甲醇：冰醋酸＝ 3 ：1）、0.075 mol / L KCI 溶液、 Giemsa染液等。 3 ．材料： 65-90 天健康小鼠（生技 09 级 72 人，新华 09 生物技术 36 人，生科 08 级 75 人，生技 08 级 70 人，共 253 人，需购小鼠 110 只） 【方法与步骤】 1．前处理 取材前 3～4 h ，向腹腔内注射秋水仙素。注射浓度随动物种类不 同而异， 一般每克体重注射 2～6 μg，注射总量不宜超过 2 ml （例如一只体重 50 g 的蟾蜍，若按 4 μg / g 注射，需注射浓度为 0.1 ％ 的秋水仙素溶液 0.2 ml ）。 秋水仙素的主要作用是使分裂细胞阻断在有丝分裂中期， 增加中期分裂相的比例。 2 ．取骨髓细胞 处死动物，用装有生理盐水的注射器反复冲洗出骨髓细胞， 并用注射器筒轻轻吹打，使细胞团块分散，静置片刻、待大组织团块沉淀后，用 吸管将骨髓细胞悬浮液移至离心管中，以 1000 r / min 离心 5~10 min ，弃去上 清液。 3 ．低渗 根据骨髓细胞液的多少，加 0.075 mol / L 的 KCI 液 5～6 ml ，在 37 ℃水浴箱中或室温下低渗 20～30 min 。低渗时间过长，易造成细胞破裂；时间 过短，则染色体难以分散。 4 ．预固定 低渗完毕，立即加入 1 ml 新配制的预冷 Carnoy’s固定液，用吸 管将细胞轻轻吹打均匀，进行预固定。然后以 1000 r / min 离心 8 min 。 5 ．固定 弃去上清液，加 5～6 ml Carnoy ’s 液，轻轻吹打细胞，静置固定 20 min 。离心弃去上清液，再加 5～6 ml Carnoy ’s液，固定 20 min 。 6 ．制备细胞悬液 离心弃去上清液，再加少许新鲜 Carnoy’s 固定液，用吸 管将固定后的细胞吹散，并反复吹打混匀，制成浓集的细胞悬浊液。 7 ．准备载玻片 滴片前 1～2 h，将洁净的载玻片放在 0～4 ℃冰水中，使其表 面附有一层水膜。这样在滴片时，细胞悬液遇到载玻片上的冷水，染色体会迅速 分散开来。 滴片法制备染色体标本 8 ．滴片 取出预冷的载玻片，将其倾斜约 30°放置。吸取细胞悬液，从距离 载玻片 40 cm 以上高度处滴至载玻片上 2～ 3 滴；滴片后立即用嘴或洗耳球对准滴 片处轻微吹气；也可用镊子夹住载玻片、在酒精灯火焰上迅速过几下（见图） ，这 样都有助于染色体分散和展开。 9 ．干燥 使滴片在室温下自然干燥，或在酒精灯火焰上烤干，也可用吹风机 冷风吹干。 10．染色 待滴片充分干燥后，用