胰酶消化贴壁细胞.pptVIP

第一页，编辑于星期六：点 二十一分。 贴壁细胞: 在体外培养条件下，必须贴附于支 持物表面才能生长的细胞。如CHO细胞。 消化：使经过分散的组织或贴壁的培养物相互或与介质解离，形成单细胞或小的细胞团的操作。 第二页，编辑于星期六：点 二十一分。 贴壁细胞的消化 贴壁细胞在培养瓶中长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，扩增、传代 。 贴壁较紧的细胞如Hela，HepG2，CHO等，则需要以细胞消化液消化后，才能脱落和分散，扩瓶 。常用的消化液为胰蛋白酶，EDTA等 第三页，编辑于星期六：点 二十一分。 主要消化方式 一、酶消化法 ( 胰酶Trypsin ) 二、离子螯合剂 ( EDTA ) 第四页，编辑于星期六：点 二十一分。 一、酶消化法 ( 胰酶Trypsin ) 1 ) 胰酶消化原理: 胰酶是一种蛋白酶。通过在特定位置上降解蛋白，使细胞膜上和培养皿壁结合处蛋白降解，使两者分离。这时细胞由于自身内部细胞骨架的张力以及培养液表面张力作用下成为球形。 细胞消化用胰蛋白酶常用的工作浓度为0.25％，pH为7.2-7.4之间。 第五页，编辑于星期六：点 二十一分。 2) 酶消化法操作过程：（以下操作均必须严格按无菌操作的要求进行）  将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去； ? 加入0.25％胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多（依培养器皿的大小而定），以使充分浸润；? ? 第六页，编辑于星期六：点 二十一分。 一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶底由半透明（细胞单层连接成片）转为点状透明（出现细小空隙）时，弃去胰酶，并加入适量的有血清培养液终止消化，吹打分散。 第七页，编辑于星期六：点 二十一分。 图示： CHO贴壁细胞 第八页，编辑于星期六：点 二十一分。 经过48小时培养 成为致密单层 第九页，编辑于星期六：点 二十一分。 加入0.25%胰酶后 细胞逐渐皱缩变圆， 细胞间隙增大不再致密 第十页，编辑于星期六：点 二十一分。 细胞明显皱缩变小， 细胞间隙增大不再致密， 部分细胞维持正常形态， 部分细胞皱缩变圆。 第十一页，编辑于星期六：点 二十一分。 细胞基本皱缩变圆 此时细胞吹打可下 第十二页，编辑于星期六：点 二十一分。 细胞完全皱缩变圆 此时应弃去胰酶， 加入培养基后轻摇 可将细胞从细胞瓶 壁上洗下，将细胞 悬液用吸管吹散后 传代 第十三页，编辑于星期六：点 二十一分。 有经验后，可肉眼对光观察贴壁半透明的细胞层，判断消化程度。 如消化过头，会见到许多细胞脱落随弃去的胰酶溶液流失,甚至造成细胞破碎。也可以在倒数第二、三步时弃去胰酶，用瓶中残留的胰酶继续作用至最后一步的消化程度，这样略有点过也影响不大 第十四页，编辑于星期六：点 二十一分。 注意事项 1．在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定 。 2. 在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被细菌污染。 第十五页，编辑于星期六：点 二十一分。 3. 胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，否则细胞铺板后生长状况会较差。消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。 4. 在37℃时,胰酶活性最强。 第十六页，编辑于星期六：点 二十一分。 5. 溶液中的Ca2+、Mg2+和血清中的非特异性胰蛋白酶抑制剂会降低胰酶活力消化过头，所以加入有血清培养基可以终止反应 第十七页，编辑于星期六：点 二十一分。 常见问题: 用胰蛋白酶消化后，细胞还是成团，原因可能是什么？ 消化时间不够； 吹打力度不够； 胰酶消化液浓度不够； 胰酶本身问题； 细胞密度过高; 第十八页，编辑于星期六：点 二十一分。 二、离子螯合剂：（EDTA） 1) EDTA消化 原理: EDTA是一种螯合剂，因为细胞表面很多和培养皿结合的蛋白都带有Ca2+, 或者Mg2+ ，而EDTA就是螯合Ca2+, 或者Mg2+ 的，从而加速细胞和培养皿的脱离 。 第十九页，编辑于星期六：点 二十一分。 2) EDTA消化液使用注意事项 1. 常用浓度在0.02%左右。 2. 在弱碱性条件下才易溶,配制时应调节好酸碱度。 3. EDTA能显著影响PH值,且不会被终和,所以消化下来的细胞要拿PBS洗一遍 第二十页，编辑于星期六：点 二十一分。 适用范围 因为EDTA不破坏细胞表面分子，仅与Ca2+,Mg2+螯合。所以适用于需检测细胞表面分子的细胞消化。 第二十一页，编辑于星期六：点