PCR技术原理、反应动力学和扩增产物 .docxVIP

PAGE PAGE 1 PCR技术原理、反应动力学和扩增产物 PCR技术的基本原理：类似于DNA的自然?复制过程，其特异性依靠于与靶序列两端互补的寡核昔酸引物。PCR由变性-退火-延长3个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时光后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作预备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延长：DNA模板一引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性一退火一延长3过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2 -4min, 2 -3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期（Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。PCR反应动力学：PCR的3个反应步骤反复举行，使DNA扩增量呈指数升高。反应终于的DNA扩增量可用Y＝（1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增强呈指数形式，随着PCR产物的逐渐堆积，被扩增的DNA片段不再呈指数增强，而进入线性增长久或静止期，即浮现“停滞效应”，这种效应期称平台期。与PCR扩增效率、DNA聚合酶的种类和活性，以及非特异性产物的竞争等因素有关。大多数状况下，平台期的到来是不行避开的。PCR扩增产物：可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是因为引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开头延长，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进人第2周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。引物在与新链结合时，因为新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延长的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内，形成长短全都的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增强，而“长产物片段”则以算术倍数增强，几乎可以忽视不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯的DNA片段供分析与检测用。