MTT法测细胞相对数目和相对活力 .docxVIP

PAGE PAGE 1 MTT法测细胞相对数目和相对活力 1．仪器倒置显微镜，CO2培养箱，一般冰箱，超净工作台，显微数码摄影系统，微量移液器，酶标仪。2．材料与试剂(1）非无菌材料酒精棉球，离心管架，血细胞计数板，记号笔。(2)无菌材料和试剂辅料镊,96孔细胞板，15ml离心管，长丝滴管，l0ml刻度移液管，灭菌塑料吸嘴，MTT溶液(5mg/ml),10%BS-RPMI1640，添加有0.02%EDTA的0.25％消化液，lmol/LHCl溶液，DMSO。(3)细胞材料贴壁细胞培养物。［操作步骤]1．接种细胞取对数期生长的贴壁细胞经消化、洗涤后制备的单细胞悬浮液，以一定密度接种在平底96孔细胞培养板上，每组设3个平行孔，每孔20μl。2．培养细胞将上述96孔细胞培养板移人细胞培养箱，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。3．呈色至收获前4h每孔加入20μlMTT溶液（(5mg/ml)，继续孵育4h后终止培养，从每孔当心吸弃上清液100μl，再加入DMSO150μl，置酶标仪上振荡10min，以使结晶物充分溶解。4．比色挑选570nm波长，在酶标仪上测定各孔的光汲取值，记录结果。[注重事项］1．设空白对比。空白对比为不加细胞只加培养液，其他步骤与试验组相同，比色时以此孔调零。2．依据试验目的、细胞种类、细胞生长习性挑选适当的细胞接种密度和培养时光长短。普通状况下，96孔细胞培养板每孔最多可以生长1×105个细胞，切不行接种密度太高，致使培养终止前细胞过满，影响试验的区别度。3．高浓度的血清会导致试验本底增强，应尽量挑选不超过10%BS的培养条件。