质粒提取原理.pdfVIP

为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液： 溶液 I ，50 mM 葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA ，pH 8.0 ； 溶液 II ，0.2 N NaOH / 1% SDS ； 溶液 III ，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。 让我们先来看看溶液 I 的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的 pH ，因此用适当 浓度的和适当 pH 值的 Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了。 那么 50 mM 葡萄糖是干什么的呢？ 说起来不可思议， 加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底 部。因此，如果溶液 I 中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以 说溶液 I 中葡萄糖是可缺的。那么 EDTA 呢？大家知道 EDTA 是 Ca2+ 和 Mg2+ 等二价金属 离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制 DNase 的活性，和抑制微生物 生长。在溶液 I 中加入高达 10 mM 的 EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金 属离子都螯合掉。如果不加 EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太 长的时间里完成质粒抽提，就不用怕 DNA 会迅速被降解，因为最终溶解质粒的 TE 缓冲液 中有 EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液 I ，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用 等体积的水， 或 LB 培养基来悬浮菌体就可以了。 有一点不能忘的是， 菌体一定要悬浮均匀， 不能有结块。 轮到溶液 II 了。这是用新鲜的 0.4 N 的 NaOH 和 2 ％的 SDS 等体积混合后使用的。要新从 浓 NaOH 稀释制备 0.4N 的 NaOH ，无非是为了保证 NaOH 没有吸收空气中的 CO2 而减弱了 碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱， 而不是 SDS，所以才叫碱法抽提。 事实上 NaOH 是最佳 的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间 就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer （双层膜）结构向 micelle （微囊）结构的相变化 所导致。用了不新鲜的 0.4 N NaOH ，即便是有 SDS 也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自 己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用 SDS 当然也能抽提得到少量质粒，因 为 SDS 也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对 NaOH 的作用误以为是为了让基因组 DNA 变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关 DNA 变性复性的描述所导致。有 人不禁要问，既然是 NaOH 溶解的细胞，那为什么要加 SDS 呢？那是为下一步操作做的铺 垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱 性条件下基因组 DNA 片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样） ，不然基 因组 DNA 也会断裂。基因组 DNA 的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。 每个人都知道，溶液 III 加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最 容易产生的误解是，当 SDS 碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往 1% 的 SDS 溶液 中加如 2M 的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与 SDS 的加入 有关系。如果在溶液 II 中不加 SDS 会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然 是盐析和酸变性沉淀出来的蛋