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光气吸入对大鼠肺组织基因表达谱的影响医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：光气吸入对大鼠肺组织基因表达谱的影响医学 1 1材料和方法 2 文2：甲醛吸入对大鼠肾组织中SODGSHCAT和MDA水平的影响医学 6 1 材料与方法 7 2 结果 8 3 讨论 8 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 11 正文 光气吸入对大鼠肺组织基因表达谱的影响医学 文1：光气吸入对大鼠肺组织基因表达谱的影响医学 光气（phosgene,COCl2）又称碳酰氯，属于高毒类窒息性毒剂，是合成化工产品的重要原料，广泛用于涂料、农药、塑料和纺织品等生产领域，由于挥发温度低（℃）、分散度高、反应快速，而被认为是具有高度潜在危险的恐怖武器［1-2］. 光气的主要毒性作用是对呼吸系统的损害，引发肺水肿［3］，但其中毒机制截至目前尚未完全阐明，临床 治疗 亦无特效措施［4-5］. 我们利用基因芯片技术，探讨光气染毒后大鼠肺组织基因表达谱的改变以及差异表达基因与肺损伤的关系，旨在从新的角度对光气中毒机制进行阐述. 1材料和方法 材料 SD大鼠10只，雌雄各半，体质量145 g ～170 g,（第四军医大学实验动物中心）；TRIzol Reagent （美国Invitrogen公司）；cRNA扩增与标记试剂盒（Lifegen公司）；RNA纯化试剂盒（荷兰Qiagen公司）；芯片杂交试剂盒（美国Agilent公司）；杂交箱（美国UVP公司，HL2000型）；芯片扫描仪（美国Axon公司，4000B型）；凝胶成像系统（美国UVP公司，G800型） 方法 样本准备 将大鼠随机分为对照组和染毒组，每组5只. 正常组未在光气中暴露，染毒组给予光气染毒（38 mg/L， 1 min）. 4 h后分别将两组动物按20 mg/Kg 用10 g/L戊巴比妥钠麻醉，充分暴露胸腔，左心房开放后经右心室沿肺动脉注入无RNA酶的水对肺组织进行灌洗以尽量排尽血液，最后在肺的同一部位剪取肺组织，经TRIzol处理，迅速置于液氮中保存. 总RNA提取和cRNA扩增 标记用RIzol试剂一步法抽提细胞总RNA，并用甲醛凝胶电泳，检测总RNA样本的质量；用紫外分光光度计，分别在260 nm，280 nm处检测cRNA的产量和纯度. 用cRNA扩增与标记试剂盒对靶物进行Cy3或Cy5荧光标记，用RNA纯化试剂盒对标记靶物进行纯化，分别在550 nm，650 nm处检测Cy3和Cy5的荧光强度，以评估荧光标记效率. 芯片杂交实验 芯片探针长度60 mer，共包括22575个样点，其中覆盖大鼠基因20 500个，positive control探针913个，negative control探针162个，空白探针1000个. 按照芯片杂交试剂盒提供的操作标准，将芯片和cRNA荧光标记靶物进行杂交. 经洗涤后，室温500 min离心10 min，甩干芯片表面液体，取出后立即进行扫描. 荧光扫描和数据处理 基因功能分类 对符合基因差异上调或下调表达标准的单个基因，通过连接基因库权威网站：和，进行基因功能比对和分类，制作光气染毒后肺组织的差异表达基因图谱. 2结果 总RNA提取质量 RNA甲醛凝胶电泳显示，28 s，18 s两条带清晰完整，证实提取的RNA无降解（图1）. 经紫外分光光度计分析，A260 nm/A280 nm值均为，说明制备的RNA纯度较高，符合实验要求. 标记效率 以效率大于8 μmol/g视为标记有效，计算得荧光标记效率分别为 μmol/g和 μmol/g，符合参加杂交反应的条件. 芯片杂交结果 差异表达基因 经对双色荧光标记杂交扫描图谱和基因表达分析散点图进行基因差异表达分析，在大鼠20 500个靶基因中，染毒组相对于对照组上调的基因有557条，其中已知基因433条，未知基因124条；下调的基因有254条，其中已知基因205条，未知基因49条. 部分显著变化的基因（表1）. 表1光气染毒后肺组织的部分差异表达基因（略） 基因功能分类 经基因生物学功能分析，将差异表达基因分为9类，其功能已知基因分类结果显示，光气染毒后细胞的能量生成下降，包括：参与糖有氧代谢的基因表达下调，如NM＿033235，编码苹果酸脱氢酶1；而参与糖异生和糖无氧酵解的基因表达上调，如BI277389，编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1. 与能量水平密切相关的部分功能基因也表达异常，如NM＿053578基因下调，编码ATP酶H+转运溶酶体9kDaV0亚基e，参与ATP合成偶联的质子运输；NM＿022235基因上调，编码钾电压阀门通道Isk相关家族成员3，参与K离子转运等（表2）. 表2差