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Thanatin突变体在大肠杆菌中的表达及纯化 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：Thanatin突变体在大肠杆菌中的表达及纯化 1 1 材料与方法 2 2 结果 5 3 讨论 7 文2：CGGBP1蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化 8 1材料和方法 9 参考文摘引言： 13 原创性声明（模板） 14 文章致谢（模板） 14 正文 Thanatin突变体在大肠杆菌中的表达及纯化 文1：Thanatin突变体在大肠杆菌中的表达及纯化 Thanatin是在昆虫斑腹刺益蝽（Podisus maculiventris）中发现的，由21个氨基酸残基组成的广谱抗菌肽，对革兰阳性、阴性菌以及某些真菌均有抑制作用，而且对一些临床上的耐药菌也有良好的抗菌活性[1]。Lee等[2]研究了thanatin的各种突变体，发现将其结构中第15位的苏氨酸残基删除后，对革兰阳性菌的抑制效果增强，而对革兰阴性菌和真菌的最小抑菌浓度不变，其二级结构仍保持thanatin原有的结构，即N末端7个氨基酸臂和C末端的14个氨基酸组成的β片层结构,通过抑制细胞呼吸达到抗菌的效果[3]。目前国内外对thanatin已有深入的研究[45]，而对具有更佳抗菌效果的突变体相关研究却比较少。本研究旨在将人工合成的thanatin突变体（ThT）基因克隆到pET32a融合表达载体中，通过正交设计考察培养基pH值、诱导剂用量及诱导时间与融合蛋白表达水平的关系，使融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中高效可溶性表达，纯化融合蛋白并经凝血酶切割，考察纯化的重组ThT作为抗菌药物的应用价值。 1 材料与方法 菌种和载体大肠杆菌菌株BL21(DE3)和pET32a载体由第一作者所在实验室保存，标准菌株大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和铜绿假单胞菌由 中国 药科大学微生物学教研室提供。 酶和试剂限制性内切酶、Taq酶、dNTPs、DNA marker、异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）为MBI产品，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，丙烯酰胺、亚甲基双丙烯胺及Tris碱为BBI产品，低分子质量蛋白质标准品为Promega公司产品；HisBind Resin为Novagen公司产品，Thrombin及其10倍缓冲液为Sigma公司产品，结合缓冲液、洗涤缓冲液及洗脱缓冲液按Novagen HisBind Resin 试剂盒配制，其余试剂为进口分装产品。 方法 ThT基因的合成与表达载体pET32aThT制备及转化 ThT基因的合成 根据ThT基因的氨基酸序列GSKKPVPIIYCNRR GKCQRM和大肠杆菌的偏爱密码子逆推出突变体的cDNA序列，并设计出PCR的引物。引物1：CGCTCGAGTTACATACGCTGGCACT TACCCCTACGGTTAC AGTAGATTATC;引物2：GCGGATCCCTGGTGCCGCGCGGCAGCAAGAAG CCTGTC CCGATAATCAACTGTAAC。单下划线序列为限制性内切酶切位点，双下划线为编码凝血酶酶切位点的序列。引物1和2互为模板，PCR扩增基因。PCR反应体系（50μl）：引物浓度2μmol·L-1，dNTPs 40μmol·L-1，MgCl2 1μmol·L-1，Taq酶 U，PCR反应程序：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 7min。 表达载体pET32aThT构建 PCR产物经纯化后用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切得到的片断由BamHⅠ和XhoⅠ位点克隆到载体pET32a，转化到大肠杆菌BL21菌株，涂布含氨苄青霉素100mg·L-1的LB平板，37℃培养过夜，挑选克隆培养提取质粒，BamHⅠ和XhoⅠ单酶切验证，进一步测序确定（由上海生工生物工程有限公司完成） 融合蛋白可溶性表达的条件优化 将测序正确的阳性菌株转入含氨苄青霉素100mg·L-1的LB培养液，37℃培养过夜。挑选1个单克隆菌落，转入含氨苄青霉素100μg·ml-1的LB培养液，37℃培养过夜作为种子液，取适量菌液。按1％的接种量放大培养，在摇瓶条件下摸索融合蛋白表达的最佳条件。正交设计在单因素考察的基础上，取4因素（培养基pH值、诱导剂用量、加诱导剂前的培养时间、诱导时间）各4水平按L16（45）进行正交设计（见表1）。其他条件包括氨苄青霉素浓度（100mg·L-1）、培养温度（37℃）、转速（200 r·min-1）等均保持一致。设定综合评分指标Y进行综合评分，Y=Y1*Y2,其中Y1为菌液OD600吸收值，Y2为融合蛋白占总可溶性蛋白的百分比。 表1 正交设计的水