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基因相关肽的制备及其应用的初步研究 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：基因相关肽的制备及其应用的初步研究 1 1 材料与方法 2 2 结 果 4 3 讨 论 5 文2：血液替代品的制备及其抗失血性休克的初步研究 7 一、血液替代品的制备： 9 1　用乙醇醛聚合牛 Hb。 9 2　牛 Hb聚合程度的检测： 9 （ 1）不连续密度梯度SDS。 9 二、抗失血性休克试验： 10 4　大鼠被随机分为六组，每组6只： 11 （1）组：不复苏组，观察休克的死亡时间及死亡率。 11 一、血液替代品的制备： 12 5　聚合产物透析后经血气分析仪检测，结果见表1： 13 二、抗失血性休克试验： 14 2 修正方式为积分值队长以标本重量。 17 参考文摘引言： 19 原创性声明（模板） 20 文章致谢（模板） 21 正文 基因相关肽的制备及其应用的初步研究 文1：基因相关肽的制备及其应用的初步研究 骨质疏松症是一种老年人和绝经后妇女的常见疾病，容易造成骨折，降低生活自理能力。甲状旁腺素（PTH）是一种由甲状旁腺分泌的激素，由84个氨基酸组成，是血钙的主要调节剂之一[1]。PTH小剂量多次给药具有明显的成骨作用，PTH（134）则完全保留了这种活性，所以PTH（134）成为目前治疗骨质疏松的理想药物[12]。PTH及其相关肽类药物都采用注射给药，频繁给药给患者带来极大的不便和痛苦。与注射剂相比滴鼻剂具有使用方便、患者依从性较好等特点，因此开发PTH（134）的滴鼻剂具有广阔的市场前景。 多肽类药物滴鼻给药，透过鼻黏膜吸收比较困难，而且易被吸收过程中的蛋白酶所降解[3]，除了从药剂学上来解决此问题，我们认为有必要对hPTH（134）进行结构改造。结构改造有两个目的，一方面为了增强其对蛋白酶的稳定性，避免吸收过程中酶的降解，另一方面增强其活性，弥补多肽类药物生物利用度较低的不足。经过查阅 文献 ，我们选定将hPTH（134）改造为ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro，采用基因工程的方法来获得该肽，并制成滴鼻剂治疗卵巢摘除大鼠的骨质疏松症验证其药效。 1 材料与方法 材料 pET28aBC为本实验室构建保存，pET28a购自TaKaRa公司，大肠杆菌BL21（DE3）为本实验室保存，CM52购自Whatman公司，二甲基β环糊精（DMβCD）购自Sigma公司，SD大鼠由 中国 药科大学动物实验中心提供，其他试剂均为进口分装或国产分析纯。 方法 ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro表达和纯化 通过PCR方法我们合成编码ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro的DNA片断，并将其插入质粒pET28aBC的BamH Ⅰ和 Hind Ⅲ两个酶切位点之间得到表达质粒pED4PhPTH(134)。在该表达质粒中，ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro是通过酸敏感位点AspPro连接到大肠杆菌门冬酰胺酶Ⅱ的C端127肽基因片段后。将该质粒测序验证后，转化 BL21(DE3)LysE后进行表达，然后经包涵体洗涤，8 mol·L-1尿素溶解，乙醇分级沉淀获得融合蛋白，再经酸水解，CM52柱层析获得目的多肽。 ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro的HPLC分析 反相柱为Shimpack CLCODS mm ID×15 cm，A相为%的三氟乙酸水溶液，B相为纯乙腈，梯度为B相从20%到70%，洗脱时间为20 min，流速为1 ml·min-1，检测波长为280 nm，进样量为20 μl，温度为室温。 ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro滴鼻剂的制备及对卵巢摘除大鼠骨质疏松症的治疗 将不同质量浓度的ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro（、和 mg·ml-1）、DMβCD(40 mg·ml-1)、聚丙烯酸（ mg·ml-1）及EDTANa（ mg·ml-1）溶解到生理盐水中，调pH ，配制成高、中、低3个浓度的滴鼻剂。 将48只200 g左右的大鼠按体质量分为正常对照（Normal）组，假手术（Sham）组，生理盐水（）组，和高、中、低剂量（HhPTH，MhPTH，LhPTH）组，每组8只。对除正常对照组外其余大鼠进行卵巢摘除手术。饲养2周后，高、中、低剂量组每日滴鼻相应浓度滴鼻剂80 μl，生理盐水组每日滴鼻生理盐水80 μl。 骨密度和骨小梁厚度的测定 连续给药12周后