外源基因的表达及其优化策略.pptVIP

第三节 外源基因在真核细胞中的表达 原核表达系统与真核表达系统的区别？ 1.原核表达系统的表达系统是原核细胞; 真核表达系统则是在真核细胞里例如酵母细胞, 昆虫细胞, 哺乳动物细胞中表达。 2.两种表达系统都是通过含有原核或者真核启动子以及其他其他表达相关元件的质粒系统来实现外源基因的表达。 3.原核表达系统与真核表达系统相比,表达量效率便于优化调整,表达量高. 但用来表达真核来源的外源基因时,由于蛋白折叠和糖链修饰不同,因此其应用受限. 真核表达系统表达量相对较低, 虽然酵母和昆虫系统表达量相对较高,但是在表达哺乳细胞来源基因同样存在折叠和糖链修饰的不足。 第九十五页，共132页 一、真核生物基因表达与调控的特点 1.基因组DNA的存在形式可影响基因表达 2.转录与翻译不偶联 3.调控是多层次的 4.具有组织和细胞类型特异性 5.对信号分子反应不同 第九十六页，共132页 二、真核生物基因表达载体的组成特征 第九十七页，共132页 二、真核生物基因表达载体的组成特征 1.原核DNA序列 2.启动子 组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、 杂合启动子 3.增强子 4.终止子 5.内含子 6.polyA加尾信号 7.选择标记基因和报告基因 第九十八页，共132页 三、真核表达的受体系统 （一）酵母表达系统 酵母是一类最简单的真核生物,其生长代谢与原核生物相似；但在基因表达与调控方面类似于高等生物。 　　　　 1、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物。如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。 第九十九页，共132页 2、酵母菌表达外源基因的优势 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的 基因工程受体系统（GRAS） 酵母菌是最简单的真核模式生物 第一百页，共132页 3、常用的宿主 酿酒酵母宿主菌 巴斯德毕赤酵母宿主菌 乳酸克努维酵母宿主菌 多型汉森酵母宿主菌 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽， 但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。 由毕赤酵母表达应用于临床的蛋白目前有胰岛素，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、人血清白蛋白，以及多种抗体等。 第一百零一页，共132页 4、酵母基因表达载体 酵母载体可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代DNA和RNA单位。 酵母菌中的野生型质粒 酵母菌克隆表达质粒的构建 第一百零二页，共132页 五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式 　2.融合蛋白 将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，这种方式表达的蛋白. 优点： 稳定性加强；具有较高的水溶性和一定的生物活性；能高效表达；易于分离纯化. 第六十三页，共132页 融合基因：通常是指通过自发突变事件形成的或是应用DNA 重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上不同基因的 核苷酸序列的新型基因。 融合蛋白质：由克隆在一起的两个或数个不同基因的编码序 列组成的融合基因，转译产生的单一的多肽序列。其中通常 受体细菌蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。 第六十四页，共132页 融合蛋白质配偶体：指融合蛋白质中与目标 蛋白质连接的别种蛋白质组分。 常见的配偶体：葡萄球菌蛋白质A(SPA)、链 球菌蛋白质G(SPG)、谷胱甘肽-S-转移酶 (GST) 、 麦芽糖结合蛋白(MBP)和硫氧还蛋白(Trx)。 第六十五页，共132页 融合蛋白表达系统的构建的三个原则： 首先，受体细菌结构基因应能高效表达，且其 表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。 其次，外源基因应插在受体菌结构基因的下游 区域，并为融合蛋白提供终止密码子。另外，两个 结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接 决定了融合蛋白的裂解方法。 最后，当两个蛋白编码序列融合在一起时，外 源基因的表达取决于其正确的翻译阅读框架。 第六十六页，共13