LPS诱导RAW2647细胞内HMGB1转位及释放实验研究.docVIP

LPS诱导RAW2647细胞内HMGB1转位及释放实验研究 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：LPS诱导RAW2647细胞内HMGB1转位及释放实验研究 1 1 材料与方法 2 2 结果 4 3 讨论 4 文2：芍药苷对LPS诱导的RAW2647细胞HMGB1表达的影响 5 1 材料与方法 6 2 结果 8 3 讨论 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 12 正文 LPS诱导RAW2647细胞内HMGB1转位及释放实验研究 文1：LPS诱导RAW2647细胞内HMGB1转位及释放实验研究 Abstract Objective：The purpose of this study was to investigate the tralocation and release of HMGB1 in LPS-induced cell. Methods: cells were incubated with different concentratio LPS for 20 hou, the distribution and levels of HMGB1 in cells were subsequently analyzed by immunofluorence and Western blot,:HMGB1 accumulation in the culture media of LPS-induced cells was significantly increased, and the accumulation of HMGB1 in the nucleus was remarkably reduced. Conclusion: LPS can induce significant release of HMGB1 in cells in a dose-dependent manner. Key words LPS; cells; HMGB1 Tralocation and release 以往研究表明，内毒素可刺激TNF-α、IL-1等早期细胞因子的合成和释放，被认为是动物多器官功能损害和死亡的核心因子。但抗TNF-α抗体 治疗 脓毒症的临床研究并未取得预期效果。新近研究发现，巨噬细胞可以产生一种新的细胞因子—高迁移率组蛋白B1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）。该细胞因子具有释放晚、持续时间长的特点，被认为是引发机体炎症级联反应的重要介质。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性杆菌的主要致病成份，本实验重点探讨LPS对细胞内HMGB1转位及其释放的影响。 1 材料与方法 材料 细胞由上海细胞生物所细胞库提供；RPMI 1640培养基购自美国GIBCO公司；新生牛血清购自杭州四季青生物制品公司；荧光免疫分析试剂盒购自苏州新波生物技术有限公司。 . 细胞的培养 复苏后的细胞置于含100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、10%新生牛血清、2 mol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培养液中培养。37 ℃ 5%CO2孵箱培养，待细胞铺满80%后以%酶、% EDTA 消化，传代培养4次以后（达对数生长期）调整细胞浓度为4×105/L（用于免疫荧光）或4×106/L（用于提取蛋白质），转种于放置了无菌处理盖玻片的6孔细胞培养板中，置37 ℃5% CO2孵箱培养，细胞单层融合达80%后，换无血清的RPMI 1640培养液，孵育2 h用于实验。 . LPS诱导细胞HMGB1转位实验 以50 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL、250 ng/mL 500 ng/mL不同剂量的LPS刺激，均于刺激20 h后，取出培养孔内载玻片，进行免疫荧光实验，显微镜下观察并拍照。 细胞活性鉴定 台盼蓝拒染实验：将刺激后的细胞用EDTA消化后吹打成单细胞悬液，取 mL %的台盼蓝染液、 mL HBSS和 mL细胞悬液，充分混匀。用毛细吸管吸取少量混合液，注入血细胞计数板小室，计数其中着色的细胞。 . HMGB1蛋白的表达测定 Western blot方法测定： 上样量为30 μg将待测样品与一倍量上样缓冲液混匀，封口，放在微量加热器中95 ℃加热5 min后，放置于冰上直至加样。各样品在15%的聚丙稀酰胺凝胶中电泳，并电转移至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉封闭过夜后，加入1∶1 000稀释的小鼠抗人的HMGB1单克隆抗体，4 ℃过夜，TBS洗膜后，加入1∶1 000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗体，室温孵育2