水通道蛋白4在急性实验性脊髓损伤中的表达.docVIP

水通道蛋白4在急性实验性脊髓损伤中的表达 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：水通道蛋白4在急性实验性脊髓损伤中的表达 1 1 材料与方法 2 2 结果 4 3 讨论 5 文2：U0126对实验性脑出血大鼠脑内水通道蛋白4表达的影响 6 1 材料和方法 6 2 结 果 8 3 讨 论 9 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 12 正文 水通道蛋白4在急性实验性脊髓损伤中的表达 文1：水通道蛋白4在急性实验性脊髓损伤中的表达 急性脊髓损伤(acute spinal cord injury，ASCI)临床上常见，常致终生瘫痪，并引起各种并发症甚至死亡。 文献 报道水通道蛋白(AQP4)与生物体内水分的调节密切相关，在急性脊髓损伤时脊髓水肿的形成和消退中起重要作用〔1，2〕。脊髓水肿是脊髓损伤后的主要并发症之一，而且影响脊髓功能的恢复。本研究旨在探讨急性脊髓损伤后AQP4蛋白及其mRNA的表达变化规律，并对脊髓损伤后AQP4的表达与脊髓水肿的相关性进行分析，进一步探讨损伤性脊髓水肿的分子生物学机制。 1 材料与方法 材料 4～5个月龄健康雄性新西兰大耳白兔48只，体重～ kg，平均 kg。根据脊髓损伤造模成功后6 h、1、3、5、7 d五个时间点随机分成实验1～5组以及对照组，每组平均8只。主要试剂：抗兔AQP4抗体(博士德)；免疫组织化学检测试剂盒及DAB浓缩显色液(迈新) 方法 建立急性不完全性脊髓损伤模型 3%戊巴比妥钠30 mg/kg静脉麻醉。咬除兔T12棘突和椎板修剪成直径约 cm的圆形骨窗，显露脊髓，在硬膜表面放置与骨窗直径一致的塑料垫片，用自制的改良Allen装置制备脊髓损伤动物模型。实验组参照预试验结果从3 cm高处击打，致伤能量60 gcm。造模成功标志：实验兔双后肢抽动后弛缓瘫。对照组只暴露脊髓节段，不打击脊髓。 脊髓标本的采取 实验组动物按照分组时间点、对照组动物于术后3d分别处死，以骨窗为中心，切取 cm的脊髓段。将脊髓标本从中心点一分为二，一半于－70℃低温保存，备RTPCR之用；另一半于4%多聚甲醛固定液中固定24 h后用蒸馏水清洗12 h，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、4 μm连续切片行免疫组织化学染色。 脊髓损伤不同时段AQP4的表达 切片常规脱蜡，3% H2O2室温浸泡10 min以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗，PBS洗；滴加正常血清封闭20 min，弃血清，直接加一抗，室温下孵育过夜，PBS充分洗；滴加二抗室温下30 min，PBS充分洗；DAB显色镜下控制，自来水充分洗；苏木素染核，脱水透明，封片光镜观察。对照实验：取相同量的正常血清代替AQP4抗体，其余步骤同前。光镜下细胞膜上出现棕黄色颗粒为AQP4免疫阳性细胞。光学显微镜下观察切片，每只兔共染色3张切片，随机选择4处灰白质阳性表达区，用图像分析仪测量脊髓损伤不同时段平均光密度(OD)值，3张切片的均值为该只兔脊髓AQP4表达的OD值。 RTPCR检测脊髓损伤不同时段AQP4mRNA的表达 不同实验组和对照组脊髓组织各50 mg进行RTPCR分析，按Trizol试剂说明提取组织总RNA；采用MMLV逆转录试剂盒按操作说明逆转录成cDNA；产物进行PCR扩增。参照基因库基因序列设计引物，AQP4引物上游序列5′TTGGACCATCATAGGCGC3′，下游序列5′GCATGTGATCGACATTGACC3′，扩增片段长约214 bp；GAPDH 引物上游引物5′GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT3′，下游序列5′AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC3′，扩增片段长约700 bp。RTPCR引物由联星公司合成。扩增条件：94℃变性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸1 min，反应30个循环后，接72℃延伸10 min。PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像分析系统中观察并照相。 统计学处理 采用统计软件处理，所有数据均采用x±s表示，采用t检验分析，并分别对脊髓损伤不同时段AQP4染色表达OD值、AQP4 mRNA的表达水平进行Peaon相关分析。 2 结果 损伤脊髓的表达 对照组脊髓AQP4在灰质和白质均有表达。脊髓灰质阳性细胞主要为神经胶质细胞，细胞膜呈棕黄色，顺中央管排列的室管膜细胞表达呈弱阳性，中央管室管膜周围、血管周围表达强烈，邻近毛细血管内皮细胞和神经元的胶质细胞突起表达亦非常丰富，神经元未见着色。脊髓白质内的纤维性星形胶质细胞、脊髓表面软脊膜也呈阳性表达，以邻近蛛网膜下腔和面向毛细血管内皮细胞的胶质细胞表现得更加突出。损伤