质粒DNA的转化资料.pdfVIP

一．实验名称：质粒 DNA 的转化 二．实验目的： 将编码目的蛋白的质粒导入大肠杆菌体内， 从而大量 扩增并表达目的蛋白 三．实验原理：转化是将外源 DNA 分子导入到受体细胞，使之获得 新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制 - 修饰 系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（ R- ， M- ）。 将对数生长期的细菌 （受体细胞）经理化方法处理后， 细胞膜的通透 性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞。 进入受体细胞的 DNA 分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体 细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养， 即可筛选出转化子（带有异源 DNA 分子的细胞） 四．实验步骤 ; 1.把固态培养基加热融化， 由于温度较热用自来水冲洗瓶身降温 （十 度左右会再凝固， 所以不能冲洗太久） ，在超净台中加入千分子一的 AP （本质粒具有抗 AP 性，故 AP 能抑制别的细菌生长），然后向 平皿中倒入少许（大约 5 毫升）培养基，表明自己名字 2. 到-80 ℃冰箱取出质粒（每瓶 100 微升，可制作两板）迅速放入冰 盘保存，放入 4 ℃保存 30min 3.将上述混合物放在 42 ℃水浴锅中融化 90s （据经验42 度 90s 最适 合），在超净台中用针尖沾取少许质粒放入大肠杆菌 EP 管内（质粒 为提纯多的所以加很少，一般未提纯的加 1 微升），再加 200 微升 无抗培养基，加完后放回冰盘（热：壁通透性大，冷 :通透性小，起 封闭作用）放入摇床 15min 。 4. 摇完后用微量加样枪析出滴到制作好的培养皿的 中央 ，然后慢慢 铺满平皿底部 （千万不能滑到边缘， 由于量比较少， 滑到边缘就不容 易再铺），表明细菌名称，实验时间，放入 4℃温箱隔夜保存 5. 观察有稀疏斑点状菌落， 从 4 度冰箱取出培养基， 在超净台中， 取 四支带帽试管（表有黄线者为抗 AP）分别倒入培养基至黄线处；用 过火的镊子夹取黄枪尖 （枪尖过火要快以防烧焦） 按象限沾取菌落一 枚，放入试管中，注意整个过程要过火。 6. 将试管放入摇床中，未完待续 五．实验结果 : 六．注意事项： 1. 培养基溶解后冲洗降温不要太久以免再凝固 2. 取 质粒尽可能的一直放入冰盒 3.42 度 90s 4. 铺板要匀！！！ 【原理】 转化是将外源 DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用 的受体细胞一般是限制 - 修饰系统缺陷变异株，即不含 限制性内切酶 和甲基化酶（ R- ， M- ）。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性 改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的 DNA 分子通过复 制和表达实现信息的转移， 使受体细胞具有了新的遗传性状。 将经过转化的细