egfp在大肠杆菌ecoli中的表达和检测.pptVIP

EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测;一;;;;;;;;;;;;pEGFP-N3质粒是一个用于在哺乳动物细胞系中表示EGFP融合蛋白 质粒, 它编码GFPmut1突变体, 发生了两个氨基酸 替换。;;;;;;;;原核表示载体通常为质粒, 经典 表示载体应含有以下多个元件: ;;;;;;;第几点;;;(含pEGFP-N3和pET-28a 大肠杆菌DH5α) （1）固-液接种: 从LB平板上挑取含有以上质粒 E.coli DH5α单菌落, 接种于5mL LB培养基中, 37 ℃振荡培养过夜。 （2）液-液转接: 以1%接种量将过夜培养 E.coli DH5α接种于新鲜LB培养基中, 37℃, 220 rpm振荡培养2～2.5h。;（1）取1.0～5.0 mL 菌液, 室温下13000 rpm离心1 min搜集细菌。 （2）倒弃培养基, 加入250 μL SolutionⅠ/RNase A混合液, 涡旋振荡使细胞完全悬浮。 （3）往重悬混合液中加入250 μL Solution Ⅱ, 轻轻颠倒混匀4～6次, 此操作避免猛烈混匀裂解液且裂解反应不超出5 min。 （4）加入250 μL Solution Ⅲ, 温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀。 （5）室温下, 13000 rpm离心10 min。 （6）转移上清液至套有2 mL搜集管 HiBind DNA结合柱中, 室温下, 13000 rpm离心1 min, 倒去搜集管中 滤液。 （7）把柱子重新装回搜集管, 加入500 μL HB Buffer, 按上述条件离心, 弃去滤液。 （8）把柱子重新装回搜集管, 加入700 μL DNA Wash Buffer, 按上述条件离心, 弃去滤液（注意: 浓缩 DNA Wash Buffer在使用之前必需按标签 提醒用无水乙醇稀释）。 （9）弃去滤液, 把柱子重新装回搜集管, 13000 rpm离心空柱2 min以甩干柱子基质（注意: 不要忽略此步——这对去除柱子中残留 乙醇至关关键）。 （10）把柱子装在洁净 1.5 mL离心管上, 加入50 μL Elution Buffer到柱子基质中, 静置1 ～2min, 13000 rpm离心1 min, 洗脱出DNA。;;;;;;;;以pEGFP-N3中 EGFP片段作为PCR反应 模板, 设计引入Eco R I酶切位点 上游引物 (5’-GGA ／ GAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’) 和引入Hind Ⅲ酶切位点 下游引物 (5’一CCG ／ AAGCTTGGCTGATTATGATCTAGAGTC-3’);;;;;;;;;;;;;;;;;;;;第几点;第几点;第几点;第几点;第几点;第几点;第几点;第几点;第几点;第几点;第几点;第几点;第几点;第几点;第几点;第几点;第几点;;