第五章DNA重组课件资料.pptVIP

IS因子本身不具有表型效应，只有当它转座到某一基因附近或插入某一基因内部后，引起该基因失活或产生极性效应时，才能判断其存在。所引起的效应与其插入的位置和方向有关。转座时，宿主靶部位双链被交错切开，经修复后插入序列两侧形成短的正向重复。靶序列通常是任意的，但交错切开的长度是固定的，一般为5～9bp。 第六十二页，共九十二页。 第六十三页，共九十二页。 （2）复合转座子（Tn） 一些转座子除了除了有转座酶基因外，还携带药物抗性(或其他)标记。这些转座子以Tn和数码来命名。其中一类是由携带药物标记的中央区域和两侧的臂(arms)组成的复合因子(composite elements)。 有的转座子的重复顺序就是IS，复合转座子也和IS一样，能从一个位点转座到另一个位点。 第六十四页，共九十二页。 第六十五页，共九十二页。 3、Ruv A B C Ruv A 识别Holliday结构连接点。 Ruv B 是一种ATP酶，为分支迁移提供动力。 Ruv C 是专一识别Holliday结构连接点的核酸内切酶，它在体外切断连接点以拆分重组中间体。 第三十页，共九十二页。 在大肠杆菌中由RuvA,RuvB和RuvC蛋白参与的同源重组。 （a） RuvA四聚体的图解。四个亚基形成的结构像四个花瓣的花。 （b） RuvA/RuvB的作用： （左）RuvA四聚体结合到Holliday位点； （中）RuvB六聚体结合到杂合双螺旋的两对面，DNA穿过其中心， RuvB六聚体的作用像马达，促进超螺旋分叉点通过复合体移动。 （右）RuvC结合到Holliday位点，由其核酸酶活性切断核酸链，切割位点由剪切体辨认。 （c） RuvA四聚体的电荷分布，蓝色表示正电荷，红色表示负电荷，注意正电荷位于四聚体的表面，有四个负电荷区域位于其中心。 （d） 假设的RuvA四聚体与Holliday位点结合的结构模型。 第三十一页，共九十二页。 RecBCD 和RecA 的共同作用 第三十二页，共九十二页。 第三十三页，共九十二页。 单链侵入 Single-strand uptake 链交换 Single-strand assimilation 第三十四页，共九十二页。 重组修复 第三十五页，共九十二页。 在复制叉处重组水平的ＤＮＡ修复 第三十六页，共九十二页。 第二节　位点特异性重组 位点特异性重组（Site-specific recombination）需要在特定的位点上发生断裂和重接，从而产生精确的ＤＮＡ重排。 位点特异性重组广泛存在于各类细胞中，起着十分特殊的作用，彼此有很大的不同。它们的作用包括某些基因表达的调节、发育过程中程序性DNA重排，以及有些病毒和质粒DNA复制循环过程中发生的整合与切除等。此过程往往发生在一个特定的短（20～200bp）DNA序列内（重组位点），并且有特异的酶（重组酶）和辅助因子对其识别和作用。 第三十七页，共九十二页。 位点特异性重组的结果决定于重组位点的位置和方向。如果重组位点以相反方向存在于同一DNA分子上，重组结果发生倒位。重组位点以相同方向存在于同一DNA分子上，重组发生切除；在不同分子上，重组发生整合 第三十八页，共九十二页。 一、λ噬菌体DNA的整合与切除 λ噬菌体DNA进入宿主大肠杆菌细胞后存在溶原和裂解两条途径，二者的最初过程是相同的，都要求早期基因的表达，为溶原和裂解途径的歧化做好准备。两种生活周期的选择取决于CI和Cro蛋白相互拮抗的结果。CI蛋白抑制除自身外所有噬菌体基因的转录，如果CI蛋白占优势，溶原状态就得到建立和维持。Cro蛋白抑制CI基因的转录，它占优势噬菌体即进入繁殖周期，并导致宿主细胞裂解。λ噬菌体的整合发生在噬菌体和宿主染色体的特定位点，因此是一种特异位点重组。整合的原噬菌体随宿主染色体一起复制并传递给后代。但在紫外线照射或升温等因素诱导下，原噬菌体可被切除下来，进入裂解途径，释放出噬菌体颗粒。 第三十九页，共九十二页。 第四十页，共九十二页。 整合和切除过程是在细菌DNA和噬菌体DNA专一性的附着位点(attachment site ,att)上进行的 第四十一页，共九十二页。 细菌的附着点称att B,由序列BOB’组成,噬菌体的附着位点称att P,由序列POP’组成。 其中O序列是att B和att P所共有的，所以称为核心序列（core sequence) 重组后形成两个新att位点，att L (BOP’) 和att R (POB’) 第四十二页，共九十二页。 位点专一性重组反应的定向特征取决于重组位点的识别。尽管整合和切除过程是可逆的，但