第七章重组子的筛选与鉴定.pptVIP

通过表达蛋白进行筛选 外源DNA引入宿主细胞后表达出蛋白质，以此为抗原与相应的抗体发生免疫反应 不依赖于基因表达产物的生物学活性,只要抗原决定序列能被正确表达 外源DNA可以是一个完整编码区，也可能是一个外显子，这些序列可以插入E.coli表达型载体 第六十二页，共一百零七页。 5. Western 印迹杂交（Western blotting ） Western杂交也与Southern杂交相似，只不过在Blotting过程中转移的是蛋白质而不是 DNA，这种将蛋白质样品从 SDS凝胶通过电转移方式转移到滤膜的方法，称为Western blotting。 其后的杂交过程不是真实意义的分子杂交，而是通过抗体以免疫反应形式检测滤膜上是否存在被抗体识别的蛋白质，并判断其分子量。所用的探针不是DNA或RNA， 而是针对某一蛋白质制备的特异性抗体。 第六十三页，共一百零七页。 Western blotting 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。 ① Western（转膜） 胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。 膜 胶 蛋白 第六十四页，共一百零七页。 Western装置 第六十五页，共一百零七页。 ② Blotting 原理与ELISA相同。 待测蛋白 硝酸纤 维素膜 一抗 二抗 辣根过氧 化物酶 底物 产物， 并发出光 PAGE胶 待测蛋白 底片曝光 辣根过氧化物酶：HRPO 第六十六页，共一百零七页。 1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。 2）洗去未结合的一抗。 3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 4）清洗掉未结合的二抗。 5）用HRPO的底物浸泡膜。 6）暗室里曝光，冲洗胶片。 ③ Blotting过程 Immuno Blotting 第六十七页，共一百零七页。 ④结果 多克隆抗体Blotting的结果 单抗blotting结果 第六十八页，共一百零七页。 方法 优点 弱点 选择顺序 1.α-互补 简洁而行 试剂贵,受材料限制 有钱首选 2.质粒快提定酶切鉴 方便易行 费时费力 无钱首选 3.插入失活 易行 受材料局限 可选 4.杂交 经典灵敏 放标/非放标 可选 4种方法选择: 第六十九页，共一百零七页。 四 免疫化学检测法及其它 直接的免疫化学检测技术，同菌落杂交技术在程度上是十分类似的。它是用抗体鉴定那引起产生外源DNA编码的抗原的菌落或噬菌斑。只要当一个克隆的目的基因，能够在大肠杆菌寄生细胞中实现表达，合成出外源的蛋白质，就可以采用免疫化学法检测重组体克隆。　　 第七十页，共一百零七页。 免疫化学检测法可分为放射性抗体测定法（radioactive antibody test），和免疫沉淀测定法（immunoprecipitation test）。这些方法最突出的优点是，它们能够检测不为寄主提供任何可选择的表型特征的克隆基因。 Antibody can be used as probes Ligand（配体） can also be used as probes 第七十一页，共一百零七页。 滤膜 + 第七十二页，共一百零七页。 利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式： 1、放射性抗体检测法 抗体与产物的多种结合方式 对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 第七十三页，共一百零七页。 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 125I 标记的二 抗结合蛋白 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 125I标记的二抗 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 固相支持滤膜 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 125I 标记的二抗 结合蛋白 125I标记的二抗 第七十四页，共一百零七页。 放射性抗体检测法过程 第七十五页，共一百零七页。 把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”(白色圆圈)。 a. 原理 抗原——抗体凝集反应。 检测分泌型产物。 b. 方法 2.免疫沉淀检测法 第七十六页，共一百零七页。 营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子 弥补缺陷 第三十页，共一百零七页。 常见的营养缺陷型筛选标记： 用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+ 用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相应的受体细胞则选择tk-缺陷型 第三十一页，共一百