植物外源基因转化方法及转化子的检测.pptVIP

3.3.2物理法诱导DNA直接转化 物理转化方法是基于许多物理因素对细胞膜的影响，或通过机械损伤直接将外源DNA导入细胞。它不仅能够以原生质体为受体，还可以直接以植物细胞乃至组织、器官作为靶受体，因此比化学法更具有广泛性和使用性。 常用的物理方法有电激法、超声波法、显微注射法和基因枪法。 电激法介导基因转化 电激法是利用高压电脉冲作用在原生质体膜上“电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。此法在动物细胞中应用较早并取得很好效果，现在这一方法已被广泛用于各种单、双子叶植物中，特别是在禾谷类作物中更有发展潜力。 电击的处理方式对转化率有着决定性的作用，有两种不同的处理方式：一种是较低的电压，处理较长的时间（350V/cm 54s）；另一种是高电压，短时间处理（1－1.25kV/cm,10s)。一般常用第二种处理方式。 电击法的转化效率与化学法相似。它除了同样具有PEG原生质体转化的优点外，还具有操作简便，DNA转化效率高，特别适于瞬时表达的研究。缺点是造成原生质的损伤。 超声波介导基因转化 超声波基因转化的基本原理是利用低声强脉冲超声波的物理作用,击穿细胞膜造成通道,使外源DNA进入细胞。 操作过程：取无菌的试管苗中部展开的叶片，切成小块，并在叶片上针刺若干小孔，放入超声小室中。同时加入5%DMSO缓冲液3ml，质粒DNA20μg/ml 及鲑鱼精DNA40μg/ml ，室温下超声处理30分钟。 超声波所特有的机械作用，热化作用和空化作用，穿透力大，在液体和固体中传播衰减小，界面反射造成叶片组织受超声波作用的面积较大等特点，使得转化效率较高。 该方法有以下优点，操作简单，设备便宜，不受宿主范围限制，转化率高等。与其他方法相比具有更大的潜力，但该转化系统尚待进行深入研究，使之完善。 显微注射介导基因转化 显微注射进行基因转化是一种比较经典的技术，其理论和技术方面的研究都比较成熟。特别在动物细胞或卵细胞的基因转化，核移植及细胞器的移植方面应用很多，并已取得重要成果。植物细胞的显微注射在以前使用很少，但近年来发展很快，并在理论技术上有所创新。 其原理比较简明，是利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体细胞质或细胞核中。显微注射的一个重要问题是必须把受体细胞进行固定。 转化的成功率高 可以省去选择性标记的麻烦 基因枪法 基因枪法又称微弹射击法。 其基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的DNA进入细胞后整合到植物染色体上得到表达，从而实现基因转化。 是继农杆菌介导法之后的第二大基因转化法。 在禾本科作物上应用较广泛。 基因枪转化的操作步骤 靶细胞或组织的预处理 微粒子弹的制备 装备基因枪 轰击 过渡培养 进行筛选培养或直接分化再生植株 PDS-1000 | He System 便携式基因枪 基因枪法转化的优点有： 无宿主限制：农杆菌介导法只对双子叶植物敏感，限制了它的应用范围。而基因枪没有物种限制。 靶受体类型广泛：可以是原生质体，叶片，悬浮细胞，茎或根切段，种子胚，愈伤组织，花粉等。 操作简单快速 但该方法转化率低，外源DNA整合机理不清楚。且形成 多拷贝 3.4花粉管通道法 花粉管通道法是将外源的DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，使外源DNA沿花粉管通道进入胚囊，转化受精卵或其前后细胞。这一技术可以应用于任何开花植物。该方法是有我国科学家周光宇等（1983）建立并在长期科学研究中发展起来的。 微注射法：一般适合于较大花的农作物如棉花等。利用微量注射器将基因溶液注射进入受精子房 柱头滴加：在授粉前后，将转基因溶液滴加在柱头上 花粉粒携带：即用基因溶液处理花粉粒，让花粉粒吸入基因，然后授粉。 植物外源基因转化方法及转化子的检测 1.概述 人们可通过有性杂交,物理化学诱变或自然变异来创造新物种和新品种。但常常存在着杂交不亲和或杂种不育而造成的生殖隔离,也存在诱变的非定向性。 植物转基因技术是生命科学前沿的重要领域之一。它是指用人工分离和修饰过的外源基因通过载体、媒体或其他物理、化学方法导入植物细胞中并得到整合和表达，并通过对转化植株的鉴定选择，从而使其遗传性状发生改变的技术。创造出人类所需要的新品种或新物种。 外源DNA通过载体介导实现其转化的系统称之为基因载体转化系统。 2.植物基因转化的受体 原生质体 悬浮细胞 胚性愈伤组织 胚状体 叶片切块 其它受体：如花、子房、离体条件下的子叶、胚轴、茎段、根和体细胞胚、花粉等 3.植物转基因的方法 外源基因的间接转化法（载体介导法） 农杆菌介导法 病毒介导法 外源基因的直接转化法