分子生物学技术PPT课件.pptVIP

* 分子生物学技术 ------2015级研究生课程 * 实验课注意事项 安全、环保、规范操作 穿白大衣 水、电、火 仪器设备、腐蚀性毒性试剂 纪律 不得使用干扰教学秩序的通讯工具和电子设备 实验室卫生值日 * 视频：离心技术 实验1：口腔粘膜细胞基因组DNA的制备 实验2：apoB基因PCR（加样上机） 实验内容 * 实验一  口腔粘膜细胞基因组DNA的制备 * 目的 通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等 是一般的基因工程实验中DNA操作的最初步骤 核酸分离纯化的总原则 保证核酸一级结构完整 排除其它分子的污染 细胞内：蛋白质、脂类、糖、RNA等 提取过程中：有机熔剂、金属离子、外源DNA 一、基因组DNA的提取与纯化 * 提取细胞样品DNA的主要步骤 裂解细胞 去除细胞内的其它分子： 蛋白质 多糖 脂类 去除盐类、有机溶剂等杂质 析出DNA * 核酸提取注意事项 减少化学因素对核酸的降解 如过量酸碱 减少物理因素对核酸的降解 机械剪切力：强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融 高温 防止核酸的生物降解 核酸酶的预防 * 二、口腔粘膜细胞基因组DNA的制备 实验目的及意义 从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组DNA 掌握基因组DNA抽提的方法，理解核酸分离纯化的基本原理 * 实验材料及试剂 材料：人口腔上皮细胞 试剂： 抽提缓冲液：Tris-Cl pH8.0 ，EDTA，NaCl， RNAase， SDS，蛋白酶K 水饱和酚 氯仿/异戊醇（V/V=24:1） 75%乙醇、95%乙醇 TE缓冲液：Tris，EDTA * 实验步骤 取材:用生理盐水漱口后，口含生理盐水10~15ml约2~3min，加入15ml离心管，4000rpm ? 10min ①，收集细胞沉淀 （离心机的使用，平衡） 加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀，转移至1.5ml EP管 （微量移液器的正确使用） 混匀，65℃ 温育30min 加入等体积的饱和酚, 充分颠倒混匀， 12000rpm?5min ② （不要剧烈震荡！） （高速离心机的使用与安全意识） * 上层水相转移至新的EP管 加入等体积氯仿/异戊醇，颠倒混匀 12000rpm?5min ③ 上层水相转移至新的EP管 加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀， 12000rpm?10min ④ * 轻轻弃去上清，打开EP盖，室温静置5~10min 加入50 ?l 0.1×TE溶液，充分混匀后检测结果 或42 ℃助溶10min后4 ℃ 保存 弃上清，沉淀中加入75%乙醇， 12000rpm?2min ⑤ * * 实验结果及分析 定性分析：DNA琼脂糖凝胶电泳 定量分析：紫外分光光度法测定DNA溶液 的浓度 * 常见问题 提取的DNA不纯 变性不充分；关键过程反应时间过短 离心时间或速度不够 提取的DNA成涂布状 操作过程中用力过猛，动作粗暴 操作系统有污染 与细胞器DNA分离不全 变性过程不完全 试剂配制问题 * 实验二 apoB基因PCR实验（加样和上机） * 取4 ?l 口腔粘膜细胞基因组DNA做PCR，剩余的统一收集于保存盒内 反应体系： 模板 4 ?l 引物 2 ?l 酶、dNTP混合物 12.5 ?l ddH2O 6.5 ?l 总体积 25 ?l 反应条件： 步骤 温度 时间 预变性 94 ℃ 5min 变性 94 ℃ 1min 退火+延伸 60 ℃ 4min 延伸 60 ℃ 5min 30循环 实验步骤 * 微量加样枪使用程序及注意事项 * * 第一步: 看整体 操作按钮 容量刻度 套头 操作按钮 容量刻度 套头 * 第二步: 看大小 20 ?l 1000 ?l 100 ?l 100 200 100 调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则加样枪将被损坏! * 0.5--10?l 20--200?l 100--1000?l 调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则加样枪将被损坏! * 第三步: 学调节 调节钮 切记: 看着刻度调大小 刻度 * 第四步: 学使用 一挡吸取二挡放 切记: * 第五步: 学维护 调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则加样枪将被损坏 切勿自行拆卸加样枪 对腐蚀性及毒性试剂等注意防范 * 微量加样枪使用程序 每次实验课前