双向电泳技术.pptVIP

2、固相pH梯度的建立 固相pH梯度等电聚焦技术的突破要归功于Immobilines试剂（Amersham Pharmacia Biotech, APB）的基础上开发的固相pH梯度（IPG）技术。Immobilines（固相试剂）是一系列性质稳定的具有弱酸弱碱性质的丙烯酰胺衍生物，与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有类的聚合行为。每个分子都有一个单一的酸性或碱性缓冲基团与丙烯酰胺单连，其结构式为： ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 其中R代表羧基或第三氨基。分子一端的双键可以在聚合过程中共价键合镶嵌到聚丙烯酰胺介质中。所以它是固相的，即使是在电场中也不会漂移。分子另一端的R基团为弱酸或弱碱性的缓冲基团，利用缓冲体系滴定终点附近一段pH范围就可形成近似线性的分布在pH3～10范围的缓冲体系。 所以固相pH梯度与载体两性电解质pH梯度的区别在于前者的分子不是两性分子，在凝胶聚合时候便形成pH梯度，不随环境电场条件的改变而改变，后者是两性分子，在电场中迁移到自己的等电点后才形成pH梯度。 * 第29页，共67页，编辑于2022年，星期五 固相pH梯度聚丙烯酰胺凝胶基质结合缓冲基团 * 第30页，共67页，编辑于2022年，星期五 4、固相pH梯度的优点和注意事项 3、固相pH梯度等电聚焦原理 蛋白质分子按照自己的pI位置在固相pH梯度中迁移，知道达到自己的等电点，停止迁移。 固相pH梯度可窄至pH0.1的范围，因此分辨率极高，可达0.001pH；pH梯度稳定，不漂移；灵活性大，可随意选择pH梯度和斜率；重复性好；加样容量大；样品中盐的干扰小；对碱性蛋白质也能很好的分离，无边缘效应，故可用很窄的胶条（如5mm宽）聚焦，特别适合于双向电泳的第一相，但固相 pH梯度灌胶技术复杂，只能使用聚丙烯酰胺凝胶，电泳时候需要高电压，电泳时间长，窄范围pH测定困难，只能计算。 注意事项：温度：20-30℃ ；电压：梯度上升。 * 第31页，共67页，编辑于2022年，星期五 加样方式 * 第32页，共67页，编辑于2022年，星期五 等电聚焦电泳进行过程中 等电聚焦电泳结束后 （－） （－） 高pH 高pH 低pH 低pH * 第33页，共67页，编辑于2022年，星期五 第三节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、基本原理:天然状态生物大分子聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）,在恒定的、非解离的缓冲系统中分离蛋白质。可得到天然蛋白质的分子量。 * 第34页，共67页，编辑于2022年，星期五 连续电泳 不连续电泳 浓缩效应 凝胶层 缓冲液离子成分 pH 电位梯度 浓缩效应 电荷效应 分子筛效应 * 第35页，共67页，编辑于2022年，星期五 2、影响凝胶聚合的因素 形成凝胶试剂的纯度 凝胶浓度 温度和氧气的影响：23-25℃ 3、聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点 * 第36页，共67页，编辑于2022年，星期五 二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、基本原理 聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulphate)SDS，蛋白电泳迁移率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。 加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白的二硫键还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到P分子上，形成蛋白-SDS，带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于蛋白分子量。 分离测定： 测分子量(与标准蛋白比较) 鉴定样品纯度(条带数目) 测定样品蛋白含量：扫描定量(比色) * 第37页，共67页，编辑于2022年，星期五 2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分类 3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的影响因素 溶液中SDS单体的浓度 二硫键是否完全还原 缓冲系统的选择 凝胶浓度的选择 * 第38页，共67页，编辑于2022年，星期五 凝胶电泳的操作要点 1.凝胶制备 2.电极缓冲液 3.样品处理及加样 4.电泳 5.染色与固定 6.脱色 7.分析 * 第39页，共67页，编辑于2022年，星期五 ？ pH值不对 = * 第40页，共67页，编辑于2022年，星期五 第四节 双向电泳 一、基本原理 IEF-SDS* 第41页，共67页，编辑于2022年，星期五 非变性2D：两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的； 非变性/SDS-2D：第一向采用非变性IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的条件下进行。适于分析非共价键连接的蛋白－蛋白间的相互作用。 非变性/还