微生物细胞的破碎.pptVIP

三．渗透压法 (Osmotic pressure) 渗透压法 将细胞放在高渗透压的介质中，达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破碎。于是，细胞内容物就释放出来。 第55页，共78页，编辑于2022年，星期日 在高压匀浆器中，高压室的压力高达几十个MPa，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度可达几百米。这种高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。 高压匀浆法的原理是利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂。 第23页，共78页，编辑于2022年，星期日 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的或高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。 第24页，共78页，编辑于2022年，星期日 破碎的动力学方程可表示为： 1n[1 / (1-R)] = Ktnpα (3-3) 式中 R-细胞破碎率； Kt-与温度等有关的破碎常数； n-悬浮液通过匀浆器的次数； p-操作压力； α-与微生物种类有关的常数。 第25页，共78页，编辑于2022年，星期日 由破碎的动力学方程可知，影响破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器的次数。 一般说来，增大压力和增加破碎次数都可以提高破碎率，但当压力增大到一定程度后对匀浆器的磨损较大。在工业生产中，通常采用的压力为55~70MPa。 第26页，共78页，编辑于2022年，星期日 细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，不同种类的微生物细胞及同种细胞在不同的环境下，其细胞壁的结构不同。 一般说来，酵母菌较细菌难破碎，处于静止状态的细胞较处于快速生长状态的细胞难破碎，在复合培养基上培养的细胞比在简单合成培养基上培养的细胞较难破碎。 第27页，共78页，编辑于2022年，星期日 不宜采用高压匀浆法破碎的微生物细胞 易造成堵塞的团状或丝状真菌 较小的革兰氏阳性菌 含有包涵体的基因工程菌（包涵体质地坚硬，易损伤匀浆阀） 第28页，共78页，编辑于2022年，星期日 高压匀浆法与珠磨法的比较 1）高压匀浆法操作参数少，易于确定，适合于大规模操作；珠磨法操作参数多，一般凭经验估计。珠磨机连续操作时兼具破碎和冷却双重功能，减少了产物失活的可能性，而高压匀浆需配备换热器进行级间冷却； 第29页，共78页，编辑于2022年，星期日 高压匀浆法与珠磨法的比较 2）珠磨法破碎在适当条件下一次操作即可达到较高的破碎率，而高压匀浆往往需循环2～4次才行； 3）珠磨机适合于各种微生物细胞的破碎，而高压匀浆不适合于丝状真菌及含有包涵体的基因工程菌。 第30页，共78页，编辑于2022年，星期日 三．超声破碎法 (Ultra sonication) 超声破碎也是应用较多的一种细胞破碎法，通常采用的超声破碎机的工作频率为15~25kHz。 第31页，共78页，编辑于2022年，星期日 超声破碎机理---超声波引起空穴现象 在相当高的输入声能下，液体各个成核部位会形成许多小气泡。在声波膨胀相中，这些气泡会增大，而在压缩相中气泡会被压缩，直到不能再压缩时，气泡破裂，释放出猛烈的震波。于是，大量声能被转化成弹性波形式的机械能，引起局部的剪切梯度使细胞破碎。 第32页，共78页，编辑于2022年，星期日 在用于细胞破碎的容器中，流体动力学按照完全混合方式，则蛋白质释放动力学遵循一级反应定律： 1 – x = exp （-kt） (3-4) 式中x为释放蛋白质的分率； k为蛋白质释放常数，min-1； t为超声波发射时间，min。 第33页，共78页，编辑于2022年，星期日 超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。 对不同菌种的发酵液，超声破碎的效果差别较大。一般地，杆菌比球菌较易破碎，革兰氏阴性细菌细胞比革兰氏阳性细菌细胞较易破碎，对酵母菌的效果较差。 第34页，共78页，编辑于2022年，星期日 采用超声破碎法处理少量样品时操作简便，液量损失少，因而在实验室规模应用较为普遍。 超声破碎法的优点 第35页，共78页，编辑于2022年，星期日 超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作时常在细胞悬浮液中加入冰块或在夹套中通入冷却剂进行冷却。但在大规模操作中，声能传递和散热均比较困难。 此外，超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活，因而有一定的局限性。 超声破碎法的缺点 第36页，共78页，编辑于2022年，星期日 四．X-press法 X-pres