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生物工程专业核心课程 基因工程的基本概念 D 基因工程的支撑技术 A 重组DNA技术的理论基础 B 基因的分子生物学 C 基因工程的基本原理 D 基因工程的支撑技术 核酸凝胶电泳技术 基本原理 电泳的迁移率同电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比. 琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶是无反应活性的稳定的支持介质,故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比，即根据分子大小、构型或形状的不同，可以通过电泳将混合物中的各种成分彼此分开。 在生理条件下，核酸分子的磷酸基团是离子化状态，因此，DNA和RNA是多聚阴离子，向正极迁移。 分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子、同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性分子要快些。 核酸凝胶电泳技术 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便是电泳介质。 凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关。琼脂糖凝胶分辨DNA的范围为0.2-50kb，而聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1-1000bp。 核酸凝胶电泳技术 核酸凝胶电泳技术 核酸分子杂交技术 核酸分子杂交技术 核酸分子杂交技术 核酸分子杂交技术 核酸分子杂交技术 1。什么是测序？ 确定一条染色体片断上的碱基顺序。 Sanger法： 在PCR时加入荧光标记的复制终止剂，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相应于4种碱基） ddX的两个作用： 可以当作正常碱基参与复制 一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接 电泳 谁终止，碱基就是谁 此方法获1974年的Nobel奖 Sanger第一步：加入复制终止剂 Sanger第二步：荧光检测 Shotgun测序 DNA的提取和纯化 载体预备：和DNA片断结合，从而能够在细菌中扩增。 DNA片段的制备：将DNA用超声波切成能够测序的小片断 转化培养：小片断和载体结合，植入细菌中进行扩增。 提质粒：从细菌中提取出繁殖好的质粒 电泳检测：检测质量的好坏 测序：上测序仪测序 全自动的测序仪器：MegaBace Shotgun测序（2）—— 还没有完！拼接！！！ 因为整个基因组太长（上M),而每次只能测得一个500的小片断(read) 问题：如何根据read恢复原始顺序？ 类比：10本圣经，都从随机点起始剪成500个字母左右的小纸条，问：给你这么一堆小纸条，你能读出圣经来吗？ Shotgun法序列拼接 拼接错误：Repeat的存在 测序之前全是生物学问题。 测序之后就全形式化是计算机问题。 天然的形式化：ATCG 核心问题： 字符串比对：两个字符串的距离 拼接问题 蛋白质结构预测：如何从一维预测三维结构？ 美国大学教授“自绘”个人基因组图谱 一台机器、3个人、5万美元，美国斯坦福大学教授斯蒂芬·夸克最近用“自绘”个人基因组图谱的经历说明，这项“游戏”已不再是谁也玩不起的了。? ????斯坦福大学10日发表声明说，夸克在两名同事的帮助下，利用一台冰箱大的单分子测序仪器，测定了自身的基因组序列，并绘制了图谱。与约10年前人类基因组计划花费的庞大资金相比，夸克只用了不到5万美元。“换言之，一项曾花费一架飞机的钱的任务，现在降到了一辆中等豪华轿车的价格”。 ????所需参与的人力也不可同日而语。声明说，尽管近年来个人基因组图谱绘制价格不断大幅下调，到去年最低时已降至25万美元，但绘制图谱仍需要200名左右的工作人员参与。而夸克的图谱绘制工作却只需要3个人。 ????这项研究成果发表在新一期英国《自然－生物工艺学》杂志网络版上。 ????据不完全统计，由于价格太高，目前全球已绘制个人基因组图谱的只有10人左右，其中一些还是免费绘制。 ????科学家指出，拥有个人基因组图谱，意味着医生可以凭此为你设计“个性化医疗方案”，更精确地治病，甚至在发病前就进行干预。 *(三)、中断杂交试验作图 在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。 二、转化(transformation) (一)、细菌转化实验 (二)、转化过程 (一)、细菌转化实验 1. 基础知识 野生型肺炎双球菌(Strep-tococcus pneumoniae)菌落为光滑型，一种突变型为粗糙型，两者根本差异在于荚膜形成；? 荚膜的主要成分是多糖，具特殊的抗原性； 不同抗原型是遗传的、稳定的，一般情况下不发生互变。 I, II 无 粗糙 无 粗糙型R I, II, III 有 光滑 发达 光滑型S 类型 毒性 菌落 荚膜 2. Griffith转化研究(1928) Griffith对其试验结论及发展 根据上述研究结果Griffith认为：