食管癌基因表达谱及其与细胞分化的相关性研究（特种医学资料）.docVIP

食管癌基因表达谱及其与细胞分化的相关性研究（特种医学资料） 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：食管癌基因表达谱及其与细胞分化的相关性研究 1 1材料和方法 2 文2：食管癌基因表达谱及其与细胞分化的相关性研究 7 1材料和方法 8 参考文摘引言： 14 原创性声明（模板） 15 文章致谢（模板） 15 正文 食管癌基因表达谱及其与细胞分化的相关性研究（特种医学资料） 文1：食管癌基因表达谱及其与细胞分化的相关性研究 0引言 食管癌（esophageal carcinoma）是人类常见的恶性肿瘤之一. 全世界每年约30万死于食管癌，其中50%在我国，每年因食管癌死亡的人数约占我国全部恶性肿瘤死亡总数的1/4，严重危害人类健康［1］. 食管癌按病理学类型主要分为鳞状细胞癌和腺癌. 两者在病因学与病理学特征上存在明显差异，在中国主要以鳞状细胞癌为主. 细胞分化异常导致上皮细胞发生恶性转化，是食管鳞癌发生的重要机制之一［1］. 随着细胞分子肿瘤学的发展，食管鳞癌分化相关基因的筛选验证、基因表达调控机制的探讨已成为肿瘤领域的研究热点. 本课题利用基因芯片技术对原发性食管癌的基因表达谱进行筛选，并探讨差异基因与食管癌细胞分化的相关性，旨在寻找或定位食管癌分化相关基因，加深对其癌变分子机制的了解。 1材料和方法 组织样本来源200301/200406郑州大学医学院附属医院普外科原发性食管癌患者15(男10，女5)例，中位年龄53岁，均经影像学、组织病理学和血清学检查，符合1990年《中国常见恶性肿瘤诊治规范》原发性食管癌诊断标准. 临床病理资料完整，15例中高分化鳞癌4例，中分化鳞癌5例，低分化鳞癌6例；无淋巴结转移、临床Ⅰ/Ⅱ期患者7例，有淋巴结转移、临床Ⅲ/Ⅳ期患者8例. 术前未接受任何放、化学治疗. 手术切除后立即取食管癌组织及相应远端正常食管上皮组织在20～30 min内快速冷冻在液氮罐中，此后保存在-80℃的冰箱中. 剩余组织标本做病理切片，并经3个病理医师分别诊断，得出共同的病理诊断报告，同时确证远端食管上皮均正常。 实验方法 (laser capture microdissection， LCM)8 μm厚连续冷 冻切片，行HE染色. 将第一张封片镜下明确病理诊断，其余切片不封片，采用PixCell LCM 200型系统（Acturus Engineering，Mountain View， California），分别获取正常食管上皮、原发灶癌细胞，每份标本各发射500次激光脉冲，大约捕获1～2×104细胞。 ，用DNase I消化去除基因组DNA. 用Oligotex mRNA Midi Kit (Qiagen公司)纯化mRNA，分光光度计测浓度和纯度，PCR检测有无DNA污染。 RNA多聚酶启动子序列加上oligo (dT)24T7 (5′GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′)作为引物，利用Supecript II逆转录酶(Gibco brL)合成双链cDNA. 用Qiaquick kit (Qiagen)将双链cDNA纯化，体外转录用T7 RNA多聚酶（MEGAscript in vitro Tracription Kit， Ambion， AUSTIN， Tex），然后用RNEASY QIAGEN kit将cRNA纯化. 用GeneQuant pro RNA/DNA Calculator (Ameharmacia biotech)检测纯化后的cRNA纯度及含量。 (TaKaRa Shuzo， 日本)进行探针标记，按说明书操作，在10 μL逆转录反应体系中加入3 μg cRNA，用Cy3dUTP/Cy3dUTP (Ameham Pharmacia Biotech)分别标记食管癌肿瘤组织cRNA和正常食管上皮组织cRNA，逆转录标记及纯化后，使用乙醇沉淀，并将两种标记的探针混合溶解在10 μL杂交液（6×SSC， 2 g/L SDS， 5×Denhardts solution， mg/mL salmon sperm solution）中。 Cancer Chip veion (IntelliGeneTM) 进行表达谱分析. 相关信息可以在其公司网站（URL：http:.jp/）查询. 芯片杂交及洗涤按公司提供的标准操作手册进行。 428 array scanner扫描芯片，观察杂交结果，用ImaGene software (BioDiscovery)分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值. 判断基因差异表达的标准：①上调基因：Cy3