PCR反应及琼脂糖电泳实验报告.docxVIP

多聚酶链式反响（PCR）扩增DNA片段及琼脂糖凝胶电泳产物检测 一、实验目的： 1、认识PCR技术的基本操作 2、理解PCR的原理 3、议论PCR的应用 二、实验原理： PCR是一种在体外模拟细胞内环境进行快速扩增DNA片段的技术，这一技术需要模板、 四种脱氧核苷酸等组分条件外，还需要不同温度环境以进行DNA的解旋和聚 1、PCR反响组分 细胞内DNA复制条件剖析： 条件 在DNA复制中 实验条件/材 参与的组分 料 的作用 模板 提供复制的模 模板DNA DNA的两条单链 板 原料 合成DNA子链 dNTPmixture 四种脱氧核苷酸 的原料 酶 催化合成DNA TaqDNA聚合 DNA聚合酶 酶 子链 酶 解旋酶 翻开DNA双链 温度控制 为DNA聚合酶 引物I 引物 引物 一小段单链DNA 或RNA 提供合成的3’端 II 起点 别的，试验中用到的还有 Mgcl2，Mg2+能激活酶的活性； 10*Buffer 缓冲液，为 Taq酶提供合适的 PH条件。 2、PCR反响条件 1 PCR利用了DNA的热变性原理，经过控制温度来控制双链的解聚与联合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。 PCR一般经历三十多次循环，每次循环能够分为三个基本步骤──变性、复性和延长。 (!)变性（模板DNA解旋） 模板DNA经加热至90℃以上。一准时间后，使模板DNA双链解离，使成为单链，以便于它与引物联合，为下轮反响作准备。 (2)复性（退火） 模板DNA经加热变性成单链后，温度降到50℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对联合。 延长 DNA模板－引物联合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板， 按碱基互补配对的原则与半保存复制的原理，合成一条新的DNA链。 循环数 变性 复性 延长 第一次（预变 94°C， － － 性） 30s 30次94℃，52℃，72℃，20s 20s20s 最后一次（保 72℃，30s 温） 3、PCR产物的检测 紫外分光光度计 DNA在260nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，能够经过与蒸馏水的对照进而计算扩增出DNA的含量。 (2)琼脂糖凝胶电泳 DNA在电厂作用下，能够由电源的负极向正极泳动，泳动的速度与DNA片段的长度成负 有关，与电压强度成正比，因此能够分别不同长度的DNA。在有DNAmarker（不同已知碱基 2 对大小的DNA片段的混淆物）的条件下，由于不同碱基大小的DNA片段在琼脂糖凝胶上涌动 的速度不同，因此电泳完成后会出现在胶块的不同地点。经过将扩增出的DNA片段与已知的 条带做比较，能够大体推断出该片段的碱基对的大小。如果要进一步检测其大小，能够换另 外规格的DNAmarker持续电泳。核酸荧光染料能够与DNA嵌合，一同电泳，DNA图谱察看 仪能够激发特定的蓝色光源，荧光染料在该光照射下可见到荧光，荧光的亮度与DNA大小成正比。 三、实验仪器及试剂 7种PCR组分微量可调移液器离心管PCR仪水平电泳槽电泳仪电源紫外分光光度计250ml锥形瓶(封口膜)记号笔卫生纸 四、实验步骤 1、DNA体外扩增 (1)将所有试剂管刹时离心一次（4000r/min,1min），使管壁没有残留药品，在引物I和引物II的离心管内用移液器各加入40ul双蒸水（ddH2O），混匀后刹时离心一次。所有的离心管都摆到双面板上。 向装有TaqDNA聚合酶的离心管按下表加入以下成分： 10xBuffer 50 μL MgCl2 50 μL dNTPmixture 20μL 上游引物(引物I) 25μL 下游引物(引物II) 25 μL 模板DNA 25 μL ddHO 290μL 2 原有的TaqDNA聚合酶有15ul，此时混淆液体系合计500ul, 此步骤由第一、二组同学 合作达成。（在实验老师的监察指导下操作，保证今后其他同学的实验顺利进行） (3)共分25组，第一、二组的同学并入其他小组进行实验。每组取 20ul的上述混淆液 于的离心管中，加入15ul 的液体石蜡关闭体系，以防备在加热过程中蒸发。 (4)对自己组的离心管上进行标记之后，放到 PCR仪上进行DNA扩增。 2、琼脂糖凝胶电泳检测 DNA （1）用蒸馏水将电泳槽和梳子冲刷洁净，放在水平桌面上，并架好梳子。 （2）配制浓度为1%（1g/100mL）的琼脂糖凝胶2块。在锥形瓶中，称取1g的琼脂糖粉，加入100ml1x电泳缓冲液，用封口膜封住瓶口后在微波炉内加热，使琼脂糖粉熔化， 3 然后冷却至60℃，倒入电泳槽中（每块胶50ml），插好梳子，待其凝结。（电泳槽首先用透明胶带将两头封住再进行倒胶） （3）待胶凝结后，去掉胶带纸，小心移去梳子，注意不要损坏加样孔。将倒胶槽至于 水平电泳槽内，梳井（点样孔）一端朝负极方向。向