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第三章 核 酸 技 术 ;核酸的分离和纯化 核酸电泳 染色体DNA电泳 DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制 DNA的连接 PCR技术 分子杂交技术 核酸序列的测定 ;第一节 核酸的分离和纯化;; 2、载体DNA分离 载体DNA 感染或转染细胞（病毒型） 转化细菌细胞（质粒型） 分离病毒颗粒 培养转化细胞、收集菌体 病毒载体DNA分离与纯化 破碎细胞 质粒DNA分离与纯化 3、DNA片段的分离 DNA 限制酶切 凝胶电泳分离 特定DNA片段的回收; 4、质量评估 1）?凝胶电泳 2）光密度值测定 3）限制酶切分析 二、细胞裂解 1.?酶法： 利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体，然后加去垢剂使原生质体裂解。 1) 细菌：溶菌酶 2) 酵母：蜗牛酶、Novozyme234、glusulase、zymolase 等 3)?丝状真菌：Novozyme234、溶壁酶、纤维素酶 4)?植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 酶法裂解时要注意细胞的生长条件和生长时间，反应时尽可能满足酶的最佳反应条件。; 2.?机械法 1)?压力剪切法：French压力机，酵母细胞，细菌（芽孢和G+球菌除外） 2)射击破碎法：Braun破碎机，搅切器（blender），混合器（玻璃球 3)固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球（0.1~0.45mm）同时致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末 4)反复冻融法 三、DNA的分离与纯化 1、供体DNA的分离与纯化 要求：尽可能地保持其高分子量，无其它污染物。 1)??? 基因组大小：;; 1)??? DNA分离纯化过程 破碎细胞 + DNA抽提液(EDTA、去污剂、还原剂) 65℃温育 20’ 冰浴冷却 离心去细胞碎片 苯酚抽提法① CsCl密度梯度离心② 1) 苯酚抽提法 上清液 缓冲液用水饱和苯酚抽提2~3次 上层液相用氯仿抽至界面无蛋白变性物 上层液相???两倍体积冷乙醇沉淀 沉淀物用70%冷乙醇洗涤,干燥 溶于缓冲液 加入RNAase处理除去RNA 苯酚氯仿抽提 沉淀干燥 ; 2) CsCl密度梯度离心 上清液 加入固体CsCl与EtBr溶液 室温下超速离心(45,000rpm）16小时 穿孔取出DNA（320nm） 异丙醇抽提溴乙锭 缓冲液透析除去残余CsCl 两倍体积冷乙醇沉淀DNA 离心、洗涤、干燥 *两种方法比较： CsCl法操作步骤少，分离DNA分子量大，耗财多，且需超速离心机。 苯酚法耗时少，不需昂贵仪器，但操作步骤多，易使DNA分子断裂。 若 小心操作，所获DNA亦符合要求。 ** 上述两种分离方法都包含了下述四个分离步骤 ⅰ.可溶与不可溶物分离：高速离心除去细胞碎片，保留上清液。 ⅱ. 使蛋白质分离：苯酚抽提或超速离心 ⅲ. 使RNA分离：RNase处理或超速离心 ⅳ. 使DNA与其它可溶物分离; 2.?载体DNA的分离与纯化 1)?质粒载体DNA的分离 关键：如何使质粒DNA与宿主染色体DNA分开 原理：质粒DNA比染色体DNA 小得多，在DNA抽提过程中，染色体DNA断裂成小片段(线状)，质粒DNA仍保持超螺旋构型 ; 方法： ⅰ. 超速离心：利用两种DN