大肠杆菌中重组尖吻蝮蛇类凝血酶的纯化及鉴定（环境论文资料）.docVIP

大肠杆菌中重组尖吻蝮蛇类凝血酶的纯化及鉴定（环境论文资料） 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：大肠杆菌中重组尖吻蝮蛇类凝血酶的纯化及鉴定 1 1 材料与方法 2 2 结论 4 3 结语 6 文2：趋化因子受体CCR5胞外段重组蛋白的克隆表达纯化及鉴定 7 1材料和方法 7 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 14 正文 大肠杆菌中重组尖吻蝮蛇类凝血酶的纯化及鉴定（环境论文资料） 文1：大肠杆菌中重组尖吻蝮蛇类凝血酶的纯化及鉴定 类凝血酶（thrombin-like enzyme）是一种丝氨酸蛋白酶[1-2]，作用于纤维蛋白原，使其产生侧链不交联的片段。该片段易被网状内皮系统吞噬或正常纤溶作用清除[3-4]，而不激活凝血因子，具有重要医药价值。受限于天然活体来源及复杂的复杂纯化条件，蛇毒类凝血酶在血栓类药物研发中难以突破[5]。本文利用工程菌构建、表达出尖吻蝮蛇类凝血酶，研究其纯化条件，鉴定其纯化效果，以期大量、高效获得活性蛋白，应用于商品化生产、利用。 1 材料与方法 菌株 稳定表达尖吻蝮蛇类凝血酶菌株（Rosetta-pET32a-acutobin）由福州大学生物工程研究所保存。 试剂与仪器 离子交换树脂填料DEAE650M、亲和层析组氨酸填料（His镍柱）保藏于福州大学生物工程研究所；重组肠激酶（EK酶）购于invitrogen公司产品；牛纤维蛋白原购于Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。 蛋白纯化系统及恒压恒流电泳仪购于东方特力科贸中心；Mini PROTEIN II电泳槽购于美国BIO-RAD公司。 重组类凝血酶表达 稳定表达尖吻蝮蛇类凝血酶菌株（Rosetta-pET32a-acutobin）于LB+培养基（LB培养基添加有氨苄青霉素），30℃，诱导剂IPTG浓度为 mmol?L-1条件下培养3h[6]，获取重组蛋白. 重组类凝血酶纯化 阴离子层析――DEAE650M 综合预实验结果，将重组菌破碎液通过阴离子层析柱（DEAE650M），通过添加、、、和 NaCl的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（PBS缓冲液）阶梯洗脱，收集峰样用紫外分光光度计测定OD280，并记录数据、绘制曲线图谱，以此获得初步纯化样品，-20℃保藏备用. 。 全过程中使用缓冲液如表1所示。 试剂 组成 平衡缓冲液 20mM PBS（ 洗脱缓冲液 20mM PBS（含不同浓度NaCl） 亲和层析――镍柱 利用重组融合蛋白表达标签（六个His残基序列）能够与二价金属离子（如镍、锌等）螯合，达到特异性吸附、分离功效。将阴离子层析收集含有目的蛋白样品，通过镍柱亲和层析再次纯化，全过程使用缓冲液如表2所示。样品经紫外分光光度计测定OD280，记录数据并绘制曲线图谱，收集纯化样品，-20℃保藏备用。 试剂 组成 镍柱活化缓冲液 NiSO4缓冲液 平衡缓冲液 20mM PBS（ 洗脱缓冲液 20mM PBS（含不同浓度咪唑、 NaCl） 重组类凝血酶鉴定 SDS 采用不连续凝胶检测，分离胶浓度%，蛋白条带用考马斯亮蓝染色[7] 纤维蛋白凝结活性 1mg? mL-1的纯化产物与9mg?mL-1的牛纤维蛋白原（均溶解于Tris-HCl缓冲溶液，，）37℃孵育1h，观察凝结现象。同时以纯水、牛纤维蛋白代替目标蛋白作对照组[8-9] 肠激酶酶切 pET32a载体在融合硫还原蛋白与自身蛋白间存在肠激酶酶切位点。取纯化样品100μl加入1U肠激酶，轻混后37℃温浴2h，利用肠激酶酶切特性，将融合蛋白酶分成两个片段，而后通过SDS电泳对片段分子量测定，初步验证重组融合蛋白。实验以纯水代替肠激酶作为空白对照组。 免疫印迹 纯化样品经SDS电泳后割下相应凝胶，利用电转法将蛋白转移至PVDF膜（电泳-割胶-转膜）；而后转移至封闭液中，室温下振摇1h（免疫：封闭）；取出、吸净残液，将蛋白面浸没于一抗液，室温孵育1h，而后用TBST室温下振摇两次，每次10min，再用TBS室温下振摇10min（免疫：一抗反应）；取出、吸净残液，用二抗液室温孵育1-2h，而后再用TBST室温下振摇两次，每次10min，TBS室温下振摇10min，取出进行显色（免疫：二抗反应） 2 结论 重组类凝血酶纯化 阴离子层析――DEAE650M 诱导表达后菌体经超声波破碎、高速离心，结果显示目的蛋白大部分存在于上清液（前期预实验已验证），为可溶性蛋白。根据蛋白质间理化性质差异，经不同盐溶液阶梯洗脱，检测OD280，收集峰样，绘制曲线，如图1所示。为判定收集样品中蛋白分布，经SDS检验，如图2所示。 通过ExPASy-Compute pI/Mw计算可知，尖吻蝮蛇类凝血酶理论分子质量