香蕉果实RNA的提取.docxVIP

香蕉果实RNA的提取 一、试剂 .十水合硼酸钠，分子量mw38L4。Sigma生产，北京欣经科生物技术公司代理。 .乙二醇双(2—氨基乙基)四乙酸(EGTA),分子量380.4。Sigma生产，北京鼎国生 物技术公司代理。 .二筑基苏糖醇(DTT),分子量154.2, Genview分装，北京鼎国生物技术公司代理。 .脱氧胆酸钠(Sodium Dexycholate),分子量414.56,北京欣经科生物技术公司代理。 . PVP—40,分子量40。Amresco生产，北京欣经科生物技术公司代理。 . Nonidet P—40, Fluka分装，北京欣经科生物技术公司代理。 .氯化锂(Lithum Chloride)分子量42.39, Amresco分装，上海生工代理。 .三羟甲基氨基甲烷(Tris),分子量121. 1。Amresco生产，上海吉泰科技有限公司代 理。 .十二烷基磺酸钠(SDS), sigma生产，舒伯伟化工仪器有限公司代理。 .乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA—Naz),分析纯天津化学试剂三厂韦斯实验用品公司代理。 .醋酸钾(KAC),分子量98.14,无水乙醇，分析纯，北京化工厂生产。 .蛋白酶K, 100mg/瓶，Merck生产，北京鼎国生物技术公司代理。 二、配制试剂 RNA提取缓冲液： 200nlM 十水合硼酸钠、30mM EGTA、1%SDS、lOmMDTT、1 %脱氧胆酸钠、2PVP —40、 0.5%NP-40o 0. IM Tris-HCL (pH 7.5)称取L2gTris碱，加入80ml RNase -free水，用浓盐酸调pH达到7. 5。 0. 5mol/L EDTA (pH 8.0)称取 18. 61g EDTA-Na ? 2H20,加入 80ml RNase-free 水和 2. 0g 左右的固体 NaOH,放 在磁力搅拌器上搅拌至固体完全溶解后，用NaOH溶液将pH值准确调整8. 0。用RNase — free水定容到100ml。 IM DTT称取L54g DTT,溶解于10ml 0. 01M pH5. 2NaAc,过滤除菌分装，贮存于一20℃。 600mmol/L KAc (pH 5. 5) 称取5. 89g KAc,溶于30ml RNase-free水中，然后加入2. 0ml冰醋酸，调pH到达 5.5,定容到 100ml。 300mM/L EGTA称取5. 7g EGTA,然后用NaOH颗粒调节pH值到达8.0。 蛋白酶K配成浓度往瓶中加入10ml DEPC处理的水，混匀，4℃保存。 75%的乙醇：配制100ml,用100ml量筒量无水乙醇75ml,加灭菌过的DEPC水定容至 100mL再装入RNA专用的试剂瓶中，4c保存。 三、耗材 .不同规格的试剂瓶、烧杯、量筒、滴管。 . 50ml离心管、1.5ml离心管。 . 一次性过滤器，孔径0.22阿、0.45网，201nl注射器。 .研钵、匀浆器、勺子、镒子、液氮。 四、仪器设备 .离心机：型号5810R, Eppendorf产品，德国。 .恒温水浴摇床 .天平 .超静工作台 五、提取方法 .称取2克香蕉果实(果皮：果肉=1： 1)速冻于液氮中，在研钵中研成粉末。 .将RNA提取缓冲液在80C温浴10分钟。待研钵复温，样品粉末略显潮湿时，加入10ml RNA提取缓冲液，匀浆2分钟。 .匀浆液转移到含5mg (10mg/ml)的蛋白酶K的40nli离心管中。 4,将离心管放在42℃, lOOrpm的恒温水浴摇床温浴1.5小时，不时混匀。 .加入1. 1ml 1. 6M KCL,并且冰浴1小时。 .然后12, OOOrpm, 4℃离心20分钟。 .上清液转移到注射器内，通过一次性过滤器(孔径0. 45MM),过滤到一新的50nli离心 管中。 .加入11ml 4M LiCL,混匀，0℃沉淀过夜。 . 12, OOOrpm, 4℃离心 20 分钟。 .倒掉上清，沉淀用5ml 2MLicL洗二次，直到上清相对无色。 .将沉淀悬浮于2ml lOmM Tris-Hcl (pH 7.5)溶液中，将沉淀重悬。 . 12, OOOrpm, 4℃离心10分钟，转移上清至另一新管。 .加入 1ml 600mM KAc (pH 5.5)，冰浴放置 15 分钟。 . 12, OOOrpm, 4C离心。分钟,将上清转移到一新的离心管中。 .上清液加入7. 5ml无水乙醇，混匀，一20℃沉淀过夜。 .用70%预冷乙醇洗涤沉淀一次，空气干燥。 .溶解于ION DEPC处理的水中，37℃助溶5分钟。 说明：本操作中所有器具均用0.1% DEPC水处理并烘干，所有试剂均用DEPC处理水配制， 整个操作过程中要经常更换一次性手套，严格防止RNase的污染。 参考文献Ch