菌种保藏方法.pdf

一、石蜡油低温保藏法 本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌 体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水 分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。保藏温度要求在 -4 4 ～ ℃下。液体石蜡法适用于不产孢子的菌种。具体操作是：菌种 为斜面培养菌种，斜面不宜过长；选择纯净优质石蜡油，置三角烧瓶 121 1 2h (160 ) 中经过 ℃高压蒸汽灭菌 ～ ，将其放烘箱中 ℃左右 干热处 理，去除灭菌时渗入的水分，待石蜡油变得清澈透明后冷却即可加入 斜面，斜面上不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面顶部约1cm 为 宜。 二、甘油管冷冻保藏法 1．试验方法介绍 本法也是利用微生物在甘油中生长和代谢受到 抑制的原理达到保藏目的。其方法是，将80%的甘油高压蒸汽灭菌待 用。将培养好的斜面菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液(108 ～ 1010/ml)。取1ml 灭菌甘油放入与甘油充分混匀，使甘油浓度约为 10%-30% -70 -20 8 ，于 ℃下冻存。 ℃保存时间较短。或采用体积比为 ： 2 的甘油－生理盐水，加入新鲜培养的菌体肉汤，混合均匀后至-20 ℃冰箱保存。 2．效果 该法适用于一般细菌的保存，同时也适用于链球菌、 弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种，适用范围广，操作简便，效果 好，无变异现象发生。甘油－生理盐水保存液保存菌种优于甘油原液， 其原因可能是加入生理盐水适当降低了甘油的高渗作用，且有肉汤培 养物适量增加保存液的营养成分，从而更好地保护了待保存的菌株。 三、真空冷冻干燥法 1．试验原理 真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏 的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、 酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物 2% 不到 。冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件 下干燥，使微生物的生长和酶活动停止。为了防止在冷冻和水分升华 过程中对细胞的损害，要采用保护剂来制备细胞悬液，使菌在冻结和 脱水过程中起到保护作用的溶质，通过氢键和离子键对水和细胞所产 生的亲和力来稳定细胞成分的构型。即是使样品中的水分在冰冻状态 下，抽真空减压，使冻结的冰直接升华为水蒸气，使样品达到干燥。 干燥后的微生物在真空下封装，与空气隔绝，达到长期保藏的目的。 2．试验步骤 1）安瓿管准备 选取规格约直径为8mm，高100mm 的中性玻 璃安瓿管，先用2%盐酸浸泡8～10h，再经自来水冲洗多次，用蒸馏 2 3 水涮洗 ～ 次，烘干；在每管内放入打好菌号及日期的标签，字面 朝向管壁，管口塞好棉塞，灭菌备用。 2）保护剂的选择及制备 冷冻干燥保藏法使用的保护剂种类很 多，效果不尽相同，通常采用高分子化合物与低分子化合物混合使用 pH 效果更好。在配制时注意比例、浓度、 和灭菌方法。一些对热敏 感的保护剂如血清等用过滤除菌，牛奶、葡萄糖及乳糖等要控制灭菌 温度。一般情况下，多数菌种可以用脱脂乳糖等要控制灭菌温度。一 般情况下，多数菌种可以用脱乳为保护剂。 3）菌种准备及分装 菌种要求为生长良好的纯种，菌龄以处于 2 3ml 稳定期为好，孢子是新鲜的。每支长好的斜面加 ～ 保护剂，用 ( ) 接种环将菌苔轻轻刮起 注意勿刮起培养基 ，制成菌悬液。如用液体 培养的菌种，则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细胞，收集的菌 体用保护剂悬浮制成菌悬液。悬液中菌数要求达到 10 8 ～ 10 10cfu/ml 为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分装安瓿时可用 灭菌的长滴入安瓿管底部，装量可依据冷冻干燥机效能而定。 4