蛋白质的研究方法.pptVIP

* 流动相： 洗脱剂--柠檬酸盐 作用：柠檬酸离子因与Ca2+有更强的相互作用， 它能大大降低蛋白质和凝胶的吸附能力。 NaCl，KCI甚至浓度高达3M时，也不影响Pr负电荷的吸附，相反这些盐可以大大降低Pr正电荷的吸附。因此在高浓度的这些盐溶液中应用羟基磷灰石进行层析时，可以专门吸附酸性蛋白质及中性蛋白质而排除碱性蛋白质。 第62页，共125页，2022年，5月20日，7点51分，星期六 * 亲和层析法 1.原理：利用生物高分子具有能和某些相对应的专一 分子可逆结合的特性。 如，酶的活性部位能和底物\抑制剂\辅助因子专 一性地结合,改变条件又能使这种结合解除. [酶的变构中心与变构因子（或称效应物）之 间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结 合蛋白与结合物之间]。 这些被作用的对象物质称之为配基（ligand) 。 ? 第63页，共125页，2022年，5月20日，7点51分，星期六 * 固定相--配基固定在固相载体上 第64页，共125页，2022年，5月20日，7点51分，星期六 * 第65页，共125页，2022年，5月20日，7点51分，星期六 * 2.优点：具有高度的吸附专一性 层析过程简便、快速 3.载体的选择： (1)必须具有高度亲水性，使Pr分子容易与它接近. (2)非专一性吸附要十分小。 (3)必须具有大量可供活化而能与配基结合的基团。 ? 常用载体：纤维素、 葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、 聚丙烯酸胺凝胶和多孔玻璃等。 第66页，共125页，2022年，5月20日，7点51分，星期六 * 高效液相层析法（High Performance Liquid Chromatography ，HPLC） 又称“高压液相色谱，是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 第67页，共125页，2022年，5月20日，7点51分，星期六 * HPLC包括： 输液系统：驱动流动相和样品通过色谱分离柱和检测系统 层析柱：分离样品中的各个物质 进样器：将待分析样品引入色谱系统 检测系统：将被分析组在柱流出液中浓度的变化转化为光学或电学信号 ，并分析显示出来 第68页，共125页，2022年，5月20日，7点51分，星期六 * 第69页，共125页，2022年，5月20日，7点51分，星期六 * 第70页，共125页，2022年，5月20日，7点51分，星期六 * 分 类 (1)液一固吸附层析 (2)液一液分配层析： 是应用最多的方法之一。 (3)离子交换层析 (4)凝胶渗透层析 第71页，共125页，2022年，5月20日，7点51分，星期六 * 　⑴液-固吸附层析：固定相是具有吸附活性的吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、高分子有机酸或聚酰胺凝胶等。液-固吸附层析中的流动相依其所起的作用不同，分为“底剂”和洗脱剂两类，底剂起决定基本色谱的分离作用，洗脱剂起调节试样组份的滞留时间长短，并对试样中某几个组份具有选择性作用。 第72页，共125页，2022年，5月20日，7点51分，星期六 * ⑵液-液分配层析：固定相为单体固定液构成。将固定液的官能团结合在薄壳或多孔型硅胶上，经酸洗、中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羟基。这种以化学键合相为固定相的液-液层析称为化学键合相层析。另一种利用离子对原理的液-液分配层析为离子对层析。 第73页，共125页，2022年，5月20日，7点51分，星期六 * 　⑶离子交换层析：原理与普通离子交换相同。在离子交换HPLC中，固定相多用离子性键合相，故本法又称离子性键合相层析。流动相主要是水溶液，pH值最好在被分离酸、碱的pK值附近。 第74页，共125页，2022年，5月20日，7点51分，星期六 * 蛋白质的检测和鉴定 第75页，共125页，2022年，5月20日，7点51分，星期六 * 一般可通过以下几个方面进行： 光谱学特性 电泳行为 特异抗体反应 特异生物学活性 N一末端氨基酸序列测定 质谱检测 排阻层析