分子生物实验课件：分子杂交技术.pptVIP

分子杂交 具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。杂交的双方是待测核酸及探针。 分子杂交的应用 分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性，因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。 实验内容与流程 人外周血单个核细胞总RNA 的分离和纯化 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） 斑点杂交 实验一 外周血单个核细胞分离、纯化 实验目的 掌握外周血单个核细胞的分离 外周血单个核细胞分离的原理 外周血单个核细胞的分离实验步骤 1. 吸取2ml淋巴细胞分离液加入5ml塑料试管； 2. 取抗凝血1ml，用1ml生理盐水稀释混匀，然后沿管壁缓慢加入淋巴分离液（上层为抗凝血，下层为淋巴细胞分离液）； 3. 2500rpm，离心20min (沉降系数不同，而分离出单核细胞)； 4. 吸弃最上层血浆，再吸取单核细胞层至一新的5ml塑料试管中，加生理盐水至管口1cm处，混匀后离心，2500rpm，5min； 5. 吸弃上清，加生理盐水500 ?l 轻柔吹打混匀后，转入1.5ml Ep管中，2500rpm，5min； 6. 吸弃上清，留细胞沉淀于Ep管中于下一步总RNA的提取。 实验二 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） 实验目的 掌握单个核细胞总RNA的提取和纯化 掌握逆转录的目的和原理 酸性酚法抽提RNA的原理 苯酚在酸性条件下既可溶解DNA，又是蛋白变性剂，联用氯仿可使细胞裂解以及蛋白质与RNA分离，最后利用异丙醇沉淀核酸，获得纯化的总RNA。 RNA极易降解，因其RNA酶分布广、活性强、且难以失活，痕量的RNA酶就能够造成严重的RNA降解，实验中采用多种措施抑制RNA酶的活性，减少RNA的降解。 注意事项——预防RNase污染 1. 人的唾液中含有大量RNase，皮肤中含有RNase和细菌，而霉菌有可能成为RNase来源 2. 要使用灭菌的RNA专用的塑料制品，避免交叉污染 3. RNA在Trizol中不会被RNase污染，我们要注意后续的实验中要使用不含有RNase的塑料制品和玻璃器皿 抑制RNA酶活性的试剂 1.焦磷酸二乙酯（DEPC)，一种强烈的烷化剂，能够和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而以抑制外源RNA酶。 2.异硫氰酸胍，一种强蛋白变性剂，可使包括RNA酶在内的所有酶活性丧失，抑制外源性RNA酶活性。 单核细胞中总RNA提取实验步骤 1. 在上述Ep管中加入500 ?l 变性液（Trizol:苯酚+异硫氰酸胍）悬浮细胞，加100 ?l 氯仿，强烈震荡或置漩涡混合器上混匀，冰浴10min。 2. 4℃，12000rpm，离心10min。吸取上层无色水相(含有RNA)转入新的1.5ml Ep管中，加入等体积异丙醇，-20℃，30min。 3. 4℃，12000rpm，离心10min。去上清，加入500 ?l 70%乙醇（不吹打！）4℃，12000rpm，离心15min，去上清，烘干。 4. 加10 ?l DEPC(焦磷酸二乙酯）水溶解RNA。 提取组织或细胞中的总RNA，采用Oligo(dT)或随机引物，利用逆转录酶特异性地反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因。 完整的逆转录反应体系除需要逆转录酶，适当的反应缓冲液，RNA模板，逆转录酶及四种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）外，还需加入RNase抑制剂。 本实验利用人外周单个核细胞中RNA逆转录成cDNA，然后再以此cDNA为模板，利用特异性引物，通过PCR选择性扩增细胞因子的cDNA序列。 实验步骤——逆转录 实验步骤—— PCR扩增 结果与分析 PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定 标明目的条带，非目的条带。 具体实验结果分析 如果实验失败，请分析原因，按实际实验出发。 实验三 斑点杂交 实验目的 掌握斑点杂交的原理及方法 是指将待测的DNA变性后点加在硝酸纤维素膜（或尼龙膜）上，用已标记的探针进行杂交，洗膜（除去未结合的探针），显色后判断是否有杂交或其杂交强度，主要用于基因缺失或拷贝数改变的检测。根据点样磨具不同，点样形状呈圆形称为斑点杂交。 斑点杂交不需要电泳和转移，杂交过程包括变性、点样、干燥固定，预杂交，杂交，封闭，检测杂交结果等步骤，相对southern印迹杂交和Northern印记杂交来说快，适合于同时分析多个样品。 杂交：加入探针3 ?l （生物素-DNA），置42 ℃恒温床上，轻轻振荡1-2h。(变性DNA与探针结合) 洗膜：倒掉杂交液，洗液1(每次5ml）洗膜三次（洗液1预热到42℃），每次5min；再将洗液2 (每次5ml）洗膜两次（预