分子生物实验课件：2 DNA的限制性酶切胶回收与连接.pptVIP

DNA的限制性酶切胶回收与连接 实验目的 掌握限制性内切酶特异性切割DNA的原理与方法 掌握DNA片段从琼脂糖凝胶中回收的原理与方法 掌握如何构建体外重组DNA分子及DNA的连接方法 DNA的限制性酶切反应的原理 限制性内切酶（restriction enzyme) 是一类识别DNA上特异核苷酸序列并产生切割反应的核酸内切酶(endonuclease)的总称。 它能够识别并结合双链DNA分子中特异的核苷酸序列，在该序列内部水解核苷酸之间的3,5-磷酸二酯键，切断DNA双链结构。 限制性内切酶识别的DNA序列一般长度为4~6个核苷酸，具有回文结构（双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列，或称为反向重复序列 ）特征。 在我们今天的实验中，用到两种限制性酶分别是HindⅢ和EcoRⅠ，这两种酶切割后产生的片段都具有粘性末端，可以保证酶切产物与载体正确的连接。 酶切反应体系（20ul） 质粒DNA(sod-T vector) ：10ul 10×M : 2ul HindⅢ : 1ul EcoRⅠ: 1ul ddH2O : 6ul 从琼脂糖凝胶中回收目的DNA 在酶切的过程中，除产生我们所需要的目的片段外，还会产生一些非目的片段，这些片段可能会对连接反应产生干扰，去除这些非目的片段的最好的方法就是进行琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收。 琼脂糖凝胶回收的原理： 不同分子量的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳中泳动速度不一样而分离。 NaI存在条件下，加热至55℃，含有DNA片段的琼脂糖凝胶就会融化，然后可利用硅胶树脂吸附DNA分子，从而得到纯净的DNA片段。 硅胶树脂在高盐离子浓度下可以高效专一的吸附DNA，通过离心可将DNA片段沉淀下来，在碱性低盐浓度下其与DNA的结合能力会急剧降低，如使用弱碱溶液如TE(pH8.0)就可以从硅胶离心柱洗脱得到纯净的DNA片段。 步骤： 取一干净的1.5ml的EP管，称重，做好标记。 紫外下用干净的手术刀切下含有目的片段（600-700bp左右）的凝胶块，放入已称重的EP管中，再次称重。 按每100mg琼脂糖凝胶块：400ul Binding Solution的量，添加Binding Solution至装有凝胶的离心管中。50-60℃放置5-10min融胶。期间可震荡混匀数次，使凝胶充分融解。 将上述混合液转移至Genclean柱中，室温放置2min，6000rpm室温离心1min。将离心下来的液体倒回Genclean柱中再重复离心一次以提高回收效率。 步骤： 弃收集管中的废液。往Genclean柱中加入500ul Wash Solution，12000rpm，1min，弃废液。 重复步骤5一次。 将Genclean柱放回收集管中，12000rpm 离心1min，彻底去除Wash Solution。 将Genclean柱放到一干净的1.5ml的EP管中，加入30ul Elution Buffer，37 ℃放置2min，12000rpm离心1min。 注意事项： 溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故切胶时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。 切胶时，尽量沿目的片段边缘切下，使其所带的琼脂糖尽量少。这样琼脂糖不会影响后面的提纯。 将目的DNA吸附在Genclean柱上，要重复回收一次，以提高目的DNA的回收效率。 Wash Solution清洗Genclean柱两次后，要再离心一次，以去除残余的Wash Solution，避免影响后续TE洗脱目的DNA。 DNA的重组连接的原理 DNA重组连接是通过将已经切开的载体和外源DNA，通过DNA连接酶催化两个双链DNA片段组邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸酯键，从而形成新的DNA。 本实验利用T4DNA连接酶，有Mg2+、ATP存在的连接反应体系中，将载体puc18与目的基因sod连接起来。 连接体系（10ul）： 目的基因（sod）：7ul 载体（puc18）： 1ul Buffer: 1ul T4DNA ligase: 0.5ul ddH2O: 0.5ul * * HindⅢ EcoRⅠ 反应缓冲液：10×M Buffer 反应缓冲液：10×H Buffer 在两者同时进行酶切时，在M Buffer里时的效率最高。因此本实验中我们用M Buffer来进行HindⅢ和EcoRⅠ的双酶切。 37℃水浴2h，加2ul 10× loading buffer终止酶切反应，取全部的样品用于电泳。