分子生物实验课件：ACE基因的扩增及多态性分析.pptVIP

* ACE基因的扩增及多态性分析 实验目的： 掌握血管紧张素转换酶基因（ACE基因）提取方法、聚合酶链式反应的原理和操作方法,多态性分析。 * 实验原理： 煮沸法提取瘦素受体基因:利用煮沸法裂解口腔脱落粘膜使得细胞破碎，DNA片段释放，基因组DNA溶解于上清中，可取做PCR反应模板。 血管紧张素转换酶基因（ACE基因）多态性分析 * * PCR原理: 在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 * ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使之成为单链，以便它与引物结合； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至25-65℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 模板DNA 94℃变性 55℃退火 72℃引物延伸 第二次循环 模板变性退火 延伸 图6-1 PCR原理示意图 PCR产物生成曲线 扩增产物 循环次数 指数扩增期 扩增平台期 * ACE： 上游 5′-CTGGAGACCACTC2 CCATCCTTTCT-3′, 下游 5′-GATGTGGCCATCACATTGGTCAGAT-3′ * ACE 血管紧张素转换酶(ACE)基因是一种与高血压、肾脏疾病、耐氧能力等有关的一个基因。 　ACE基因的基因型鉴定，存在I/D (插入/缺失)多态性,从而导致出现3种基因型：插入型纯合子片段,即仅有490 bp区带者为Ⅱ型;缺失型纯合子片段,即仅有190 bp区带者为DD型；杂合子片段为既有190 bp区带又有490 bp区带者为ID型。因此,电泳结果中可见到DD、ID及Ⅱ型共3种基因型。 主要功能有以下两个： 催化血管紧张素I转化为血管紧张素II； 使缓激肽失活。 血管紧张素转化酶因为这两种功能而成为治疗高血压、心力衰竭、2型糖尿病和糖尿病肾病等疾病的理想靶点。此外，ACE也能催化血管紧张素（1-9）转化为血管紧张素（1-7）。 * 一、基因组DNA提取： 吸取200μlddH2O至EP管中，用棉签刮拭口腔粘膜3-4次，将其放入ddH2O中反复挤压搅动，使细胞脱落； 12000rpm 3min，弃上清； 加入100μl TE溶液，悬浮细胞； 56℃ 30 min; 100℃煮10min; 12000rpm 3min，取上清作为PCR反应的模板; 4℃保存或冻存剩余DNA。 实验步骤： * 二、PCR扩增： 30ulPCR体系： 10×缓冲液: 2.0ul dNTP: 1.0ul 引物： 各1.0ul 模板： 10ul Ex taq: 1U 加ddH2O至30ul PCR扩增条件： 94℃ 3min 94℃ 40s 58℃ 40s 72℃ 40s 72℃ 10min 35个循环 [注意事项] 1、 重点防止DNA的损伤，包括各种物理、化学和机械损伤。 2、 取上清时，如果上清液过少，可再加入少量水，重新离心，取上清，避免DNA损失过多。 3、 避免其它分子的污染。 4、尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 DNA以指数形式进行扩增，但是DNA的指数扩增并不能无限期的进行下去，PCR循环后期，由于引物、dNTP消耗、DNA聚合酶活力下降等因素使得扩增产物累积趋于饱和，原来以指数递增的速率曲线变成平坦的曲线，这种现象称为平台效应。 DNA以指数形式进行扩增，但是DNA的指数扩增并不能无限期的进行下去，PCR循环后期，由于引物、dNTP消耗、DNA聚合酶活力下降等因素使得扩增产物累积趋于饱和，原来以指数递增的速率曲线变成平坦的曲线，这种现象称为平台效应。