分子生物实验课件：外周血单个核细胞总RNA的分离、纯化与RT-PCR.pptVIP

* * （一）感受态细胞的制备——均需在冰上操作 1. 取菌液1.5ml于离心管中，冰浴5min后，4℃离心， 4000rpm,10min,去上清液，收集菌体。 2. 将0.5ml冰预冷的0.1mol/L Cacl2轻轻悬浮细胞，冰浴15min。 3. 4℃离心， 4000rpm,10min。 4. 弃上清，加入50ul预冷的0.1mol/L Cacl2，小心悬浮细胞 5. 制备好的感受态细胞放冰上进行下步试验。 * （二） 感受态转化 1 在上述Eppendorf管中加入10ul连接反应液，温和混匀（轻度摇晃），于冰上放置30min(Eppendorf管和移液器枪头要提前预冷）。 2 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90s，然后将EP管迅速转移到冰浴，冷却1-2min. 3 向管内加入400ul的LB培养液，然后37℃100rpm振荡培养45min。 4 取100ul的转化细胞转移到含有Amp抗生素和X-gal的LB固体平板上，用灭菌棒涂布均匀。室温放置几分钟，然后倒置放入37度恒温培养箱过夜，观察是否有菌落。 * 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性 法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化 碱裂解提取质粒原理：主要利用宿主染色体DNA与质粒DNA之间的结构和大小的差异进行分离提取的。 EDTA的作用：DNA酶属于金属离子依赖酶，EDTA可螯 合金属离子，使DNA酶失活，更有利于DNA的分离 * 质粒DNA的酶切 目的：限制性内切酶切割出目的DNA 原理：利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位点，定点切割环状质粒DNA。 质粒DNA小量提取： 一、收获 1）在含相应抗生素（Amp）的LB中接入一单菌落，于37℃剧 烈振摇下培养过夜。 2）将1.5ml培养物倒入Ep管中，室温 8000rpm离心30s，收集菌体 3）弃上清，将EP管倒置在吸水纸上，吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥 二、碱裂解 4）加100μl用冰预冷的溶液Ｉ(GTE缓冲液）中，旋涡振荡器剧烈振荡 5min。须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散。 5）加200μl新配制的溶液Ⅱ（NaOH-SDS）。盖紧管口，快速颠倒Ep管5-10次以混合内容物。不要振荡，将Ep管放置于冰上5min。 6）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ（乙酸钾溶液）。盖紧管口，温和颠倒数次使混匀，溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上5min。 7） 4℃ 12000rpm离心5min，取上清 （300ul左右）转移到另一Ep管中。 8）加等体积体积异丙醇，振荡混匀，冰浴30min, 4℃12000rpm离心10min,弃上清 三、质粒回收 9）用0.5ml预冷70%乙醇洗涤沉淀，静置2min, 4℃12000rpm离心5min,弃上清，在空气中使核酸沉淀干燥10 min。（可用吹风机吹干） 10）沉淀溶于20μl TE（含RNaseA20μg/ml）， 37℃放置10min以降解RNA分子。 2、质粒的酶切鉴定： 1） 质粒DNA酶切反应体系 10?酶切buffer 1 ?l 质粒DNA 5 ?l EcoR1（10u/?l） 1 ?l BamH1（ 10u/?l ） 1 ?l ddH2O加至 2 ?l 37℃水浴保温1-2h；72 ℃水浴15min终止反应。 3、电泳检测目的基因片段（电泳方法同前） 4、结果分析 四、注意事项 1、抽提质粒过程应尽量保持低温 2、质粒制备过程中要尽量除去蛋白，否则会影响后面的酶切或连接 3、沉淀DNA常用等体积的异丙醇，但易将盐也沉淀下来，可以用二倍体积的冰乙醇避免盐的沉淀。 五、思考题 1、碱裂解法提取质粒的原理？ 检验医学院、生命科学学院 WenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院 12月15日DNA重组技术（一）—RNA提取、RT—PCR 12月21日DNA重组技术（二）—电泳鉴定、纯化、连接 12月22日DNA重组技术（三）—感受态的制备、转化、培养 1月5日DNA重组技术（四）—重组质粒的提取、酶切鉴定 原理：trizol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此trizol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。氯仿虽然有变性蛋白质的作用，但是其主要用处是用来分相，实际上是加速有机相和水相的分层。当