分子生物学检验：线粒体疾病的分子生物学检验.pptVIP

Disorders of mtDNA maintenance Disorders of mitochondrial protein synthesis Thanks! * * * 线粒体疾病的分子生物学检验 线粒体（mitochondrion） 线粒体是一种存在于大多数真核细胞中的由两层膜包被的细胞器，直径在0.5-10μm 结构： 外膜：平滑，脂类/蛋白=50%/50% 嵴：内膜内折，扩大内膜面积，提高氧化磷酸化酶附着面积和局部浓度和排序 内膜 ：脂类/蛋白=20%/80% 基质：基质颗粒，包含三羧酸循环的酶 功能： 三羧酸循环 氧化磷酸化 一、线粒体基因组与疾病 线粒体有半自主的DNA复制（mtDNA）、转录和蛋白质的翻译系统 mtDNA较小，16,569 bp 基因结构及排序简单，无内含子，非编码序列少，同一个体为单倍体 每个细胞内有数百个至几千个拷贝 （一）、线粒体基因组及其表达系统 人类线粒体基因组DNA，闭合环状双链分子 编码区，37个基因： 13个蛋白多肽、 22个 tRNA基因 2个 rRNA基因 6%非编码区 （一）、线粒体基因组 结构基因：细胞色素b基因，细胞色素氧化酶3个亚基，NADH氧化还原酶7个亚基，ATPase 2亚基，共13个，构成线粒体内膜呼吸链的重要成分。 tRNA基因：共22种，转录20种tRNA（tRNALeu和tRNASer都有两个基因） rRNA基因：12S rRNA和16S rRNA 非编码区：D-Loop和L链复制起始区 密码子：AUA-起始密码子，UGA-Trp, AGA、AGG-终止密码子 复制：半保留非同步复制,重链逆时针、轻链顺时针方向复制 转录：对称，tRNA处剪切，mRNA 3‘ polyA 尾巴，无5‘ 帽子 蛋白质合成：13个蛋白多肽在线粒体合成，其他的蛋白合成的起始因子、延伸因子、释放因子以及核糖体蛋白质…在胞浆合成 （一）、线粒体基因表达系统 （二）、线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系 mtDNA与nDNA关系：位置独立，密切联系 交叉对话机制： 核呼吸因子-1/2（NRF-1/2）作用于mtDNA和nDNA,调节呼吸链亚基的合成，影响氧化磷酸化 激素、生长因子或外部刺激作用于mtDNA和nDNA （三）、线粒体基因组变异与疾病 mtDNA无组蛋白，易积累损伤并变异 mtDNA变异 同质性变异：细胞内所有的mtDNA发生同样的变异 异质性变异：细胞内仅一部分的mtDNA发生某一变异，程度与疾病的发病及病情的严重程度相关 线粒体基因组的变异 数量 变异：mtDNA的拷贝数变异 结构变异：mtDNA的碱基突变、插入和缺失等… （三）、线粒体基因组变异与疾病 碱基突变 点突变：降低线粒体内蛋白质的合成能力，从而影响线粒体的氧化磷酸化，导致疾病的发生。Leber遗传型视神经病：ND1基因中的G3460A，ND4基因中的G11778A 缺失与插入 缺失： mtDNA的异常重组，常发生于神经性疾病及一些退化疾病，如KSS综合征 插入：较少见 mtDNA拷贝数目突变 拷贝数大大低于正常，较少见 二、线粒体基因组与耳聋 mtDNA突变是导致耳聋发生的重要原因之一 12S rRNA基因的A1555G和C1494T突变: 是氨基糖甘类抗生素耳毒性的主要分子致病基础 tRNASer(UCN)T7511C:非综合征型耳聋 tRNALeu(UUR)A3243G:综合征型耳聋 继发突变对原发突变起协同作用 （一）、与耳聋相关的mtDNA突变 PCR-RFLP技术 限制性内切酶如Alw26 I、Apa I和Xba等来检测mtDNA A1555G、A3243G和A7445G突变 DHPLC技术 DNA测序技术 基因芯片技术 （二）、耳聋相关的mtDNA突变的检测 三、线粒体与Leber遗传性视神经病变 Leber遗传性视神经病变(LHON)是一种主要累及视网膜、巩膜筛板前部视乳头黄斑束纤维，导致视神经变性的母系遗传病。mtDNA突变是LHON发病的分子基础。 ND1 G3460A、ND4 G11778A、ND6 T14484C等三个最主要的原发突变 tRNAMet A4435G、 tRNAThr A15951G等继发突变与原发突变起协同作用 (一)与Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变 PCR-RFLP技术 DHPLC技术 DNA测序技术 基因芯片技术 （二）、LHON相关的mtDNA突变的检测 四、线粒体与糖尿病 1992年van den Ouweland等首次发现1个糖尿病家系有mtDNA tRNALeu(UUR) A3243G,1999年WHO将线粒体归为特殊糖尿病中的一种，目前已经发现有几十个突变位点，但tRNALeu(UUR) A3243G仍是目前国