分子生物实验课件：PCR产物纯化、连接.pptVIP

注意事项： Solution I 请于冰中融解。 连接反应请在 25℃以下进行，温度升高（26℃）较难形成环状 DNA。连接效率偏低时，可适当延长连接反应时间至数小时。 PCR产物纯化以及TA克隆 PCR产物纯化 TA克隆 实验内容 PCR产物纯化的原理 在高盐存在的情况下，DNA片段选择性的吸附于离心柱内的硅胶基质膜上，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，去除蛋白液和漂洗液将引物，核苷酸，蛋白酶等杂质去除，最后低盐，高PH值的洗脱缓冲液将纯净DNA从硅胶基质膜上洗脱。 PCR产物纯化实验步骤 1.PCR反应结束后，从PCR反应管中将反应液移至干净的1.5ml离心管中，加入5倍体积的Binding Solution，上下颠倒混匀。（如欲纯化的PCR反应液体积不足50ul，加灭菌水补足到50ul。） 2.将混合液转移到套放收集管的 GenClean 柱中,室温放置 2min，于 8000rpm 离心 1min。 3.取下 GenClean Column, 倒掉收集管中废液。将废液转移回 GenClean Column 重复步骤 2 和 3 (可适当提高回收效率)。 4. 将 GenClean 柱重新放回收集管中，加入 500μl Wash Solution，于 12000rpm 离心 1min，倒掉收集管中废液。 5. 重复步骤 4 一次。 6. 将 GenClean 柱重新放回收集管中，12,000 rpm 离心 1min，以彻底去除 Wash Solution。将 GenClean 柱室温开盖放置 10min 或 50℃放置 5min。（有助于 Wash Solution 中的乙醇完全挥发干净） 7.将 GenClean 柱放入干净的 1.5ml 离心管中，在 GenClean 柱吸附膜的中央小心加入 30～50μ l Elution Buffer，37℃放置 2min。12,000rpm 离心 1min，离心管中的液体即为纯化好的 DNA 片段。（Elution Buffer 或去离子水加热至 65℃将提高洗脱效率） 8. 纯化好的 DNA 可立即用于后续实验或于-20℃冻存。 TA克隆技术（TA cloning）利用Taq聚合酶具有末端转移酶（TdT）活性，但却不具有3‘-5’端外切酶校准活性的特点，可在PCR产物的3’端加上一个非模板依赖碱基“A”。 pMD19-T Vector 是一种高效克隆 PCR 产物（TA Cloning）的专用载体。本载体由 pUC19 载体改建而成，在 pUC19 载体的多克隆位点处的 Xba I和 Sal I识别位点之间插入了EcoR V 识别位点，用 EcoR V 进行酶切反应后，再在两侧的 3’端添加“T”而成。能高效地与带“A”尾的PCR产物连接。 TA克隆 TA克隆原理图 1.在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 5 μl。 2.加入 5 μl（等量）的 Solution I。 3.16℃反应 30 分钟 TA克隆实验步骤 Ficoll分层液即聚蔗糖-泛影葡胺，是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。 红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞 *