分子生物实验课件：斑点杂交（6，7，8）.pptVIP

RNA提取、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） （一）人外周血单个核细胞总RNA的分离纯化 （二）逆转录聚合酶链反应扩增细胞因子mRNA 原理 真核生物基因结构特点为断裂基因，因此不易直接由基因组克隆目的基因，提取RNA并逆转录成cDNA是获取真核生物基因的主要手段。 抽提RNA的关键在于去除DNA和蛋白质，利用酸性酚试剂与氯仿的抽提，可以一步完成细胞的裂解以及蛋白质与RNA的分离。（苯酚在酸性条件下可以溶解DNA而不溶解RNA，同时酚又能使蛋白质变性） 原理 RNA分子很容易被降解，因此有效去除内外源性RNA酶非常关键。 焦磷酸二乙酯（DEPC） （ DEPC是一种强烈的烷化剂，能够和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而以抑制外源RNA酶） 异硫氰酸胍 异硫氰酸胍是一种强蛋白变性剂，可使包括RNA酶在内的所有酶活性丧失。 逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 逆转录酶 ＤＮＡ聚合酶 RNA（mRNA） cDNA 杂化双链 PCR扩增 实验目的 首先利用人外周血单个核细胞中RNA逆转录合成cDNA，然后以cDNA为模版，利用特异性引物，通过PCR选择性扩增细胞因子的cDNA序列。 实验步骤 1. 人外周血单个核细胞的分离 1.吸取2ml淋巴细胞分离液加入玻璃试管 2.去抗凝血1ml，用1ml生理盐水稀释混匀，然后沿管壁缓慢加入淋巴分离液上层。 3. 2500rpm，离心15min(沉降系数不同，而分离出单核细胞) 4. 吸取最上层，再吸取单核细胞层至一新的试管中，加生理盐水至管口1cm处，混匀，2500rpm,5min 5.去上清，加生理盐水0.5ml 吹打混匀后，转入大EP管中，5000rpm,2min 6.去上清 实验步骤 2. 单个核细胞总RNA抽提纯化（异硫氰酸胍－酚－氯仿一步法） ① 在留有细胞沉淀的离心管中，依次加入500mL变性液（先吹打混匀）、 100mL氯仿/异戊醇（49/1），置漩涡混匀器上混匀，冰浴10min。 ② 4℃ 12000rpm，离心10 min。取上层水相转入新的EP管，加等体积异丙醇，-20℃，30min。 ③ 4℃ 12000rpm，离心10 min，倒去上层异丙醇，加入500mL 70％乙醇进行洗涤（不吹打）， 4℃ 12000rpm，离心2 min，倒去70％乙醇，留沉淀，干燥箱干燥（2.5h） ④ 用10mLDEPC处理水溶解沉淀， -20℃保存，备逆转录之用。 实验步骤 3. 逆转录 ① 按以下组成调制反应液 样品总RNA 5mL AMV逆转录酶 20u 随机引物 100pmol 脱氧核苷三磷酸 2.0mL 逆转录缓冲液（5×） 4mL RNasin（20-40U/mL） 0.5mL DEPC处理水 补至20mL ② 30℃ 10min，42 ℃ 30min，95 ℃变性1分钟。逆转录产物于4 ℃保存. RT-PCR 聚合酶链反应（PCR）扩增细胞因子mRNA，电泳鉴定 实验步骤 4. PCR扩增 ①按以下组成调制反应液 cDNA模板 5.0mL 特异细胞因子引物（25umol/L） 2.0mL 脱氧核苷三磷酸 4.0mL PCR缓冲液（10×） 5.0mL MgCl2（25mmol/L） 3.0mL 双蒸水 补至49mL 以逆转录阴性对照取代cDNA模板作为PCR阴性对照，将上述反应成份加于0.5ml EP管，混匀，短暂离心。 ②扩增： 94 ℃ 5min，热循环条件： 94 ℃ 45s，56 ℃ 30s， 72 ℃ 30s，循环30次。最后72 ℃延伸5min。 PCR产物于4保存待用。 斑点杂交（三）