分子生物实验课件：感受态制备、转化.pptVIP

一、感受态细胞的制备 感受态：指受体最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状决定的，同时也受菌龄，外界环境因子影响。处于感受态的细胞称作感受态细胞。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和成功转化的关键。 正常状态下，细菌会分泌一种酶将外源DNA降解，只有某一生长阶段中的细菌才能做为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞的生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。细胞通透性增加，能接受外来的DNA分子进入细 胞。 一、感受态细胞的制备 CaCl2法 使细菌处于0℃、CaCl2低渗液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性改变，转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶降解的羟基-钙磷酸复合物，此复合物黏附于细菌细胞表面。42°短时间热处理可以促进细胞吸收DNA复合物。这个也是CaCL2的作用。 二、转化 吸附：双链DNA分子吸附于受体菌表面； 转入：双链DNA分子解链，一条链进入受体菌，另一条降解； 自稳：外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链； 表达：供体基因随同复制子同时复制，分裂，转录翻译。 感受态制备 1、取1.5ml菌液冰浴10min后，4000rpm，4℃离心10min，弃上清，收集菌体； 2、用500μl冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞(一直放在冰上操作)； 3、4℃离心10min，4000rpm ×10min； 4、弃上清，加入50μl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞,冰浴30min. 细菌转化 1、在1.5mlEp管中加入50 μl感受态细胞悬液和10 μl重组质粒DNA溶液，温和混匀（轻度摇晃），于冰上放置30min（Ep管和移液器枪头要预冷） 2、将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90s（不要摇动Ep管），然后将Ep管迅速转移到冰浴，冷却2min 3、立即向上述管中加入400μl 的LB液体培养夜，然后37℃振荡培养约45min 。（此时间段可以去吃饭） 4、取100μl转化细胞转移到含有抗生素的LB固体平板上，用灭菌的玻璃棒涂布均匀，（玻璃棒酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫），室温放置几分钟待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养过夜。 三、重组子的鉴定与筛选 1、抗生素筛选法 不同质粒上自身携带有不同抗生素的抗性基因，当其转入宿主菌成功表达后，利用其产生的相对抗性进行目的菌株的筛选 * WenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院 WenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院 DNA重组技术（二）－感受态制备、转化 实验目的 1、掌握大肠杆菌感受态的制备及转化的原理 2、熟悉实验的操作具体步骤，掌握无菌操作技术 3、掌握抗生素、蓝白斑筛选重组质粒转化成功的克隆菌 2、蓝白斑筛选法（α互补法） 许多载体上都带有lacZ′基因，具有大肠杆菌β-半乳糖苷酶的启动子及其α肽链的DNA序列。 宿主菌细胞中具有编码β-半乳糖苷酶C端肽链的DNA序列。 两者可以通过互补的机制形成有功能活性的β-半乳糖苷酶分子，此为α互补法。 β-半乳糖苷酶分解显色底物X-gal显蓝色。 当外源片段插入， lacZ基因不能表达，菌株呈白色。 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 IPTG 结果说明 含抗菌素的平板 组别 说明有重组质粒导入细胞中（有时还需要酶切等进一步鉴定〕 白色菌落和少量蓝色菌落 实验组 培养皿内菌落生长状况及结果分析