分子生物实验课件：1 质粒DNA的提取和电泳鉴定.pptVIP

分子克隆技术 分：分离目的基因。（实验一） 切：限制酶切割目的基因与载体。（实验二） 接：拼接重组体。（实验二） 转：转入受体菌。（实验三） 筛：筛选重组体。（实验三） 质粒DNA的提取和电泳鉴定 实验目的 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法。 了解实验中所使用试剂的作用。 基本原理 碱裂解法是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到分离的目的。 基本原理 当菌体在NaOH-SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA会发生变性。加入中和液（乙酸钾）后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；而染色体DNA、大分子RNA以及蛋白质-SDS复合物等形成沉淀，可通过离心去除。 试剂中的主要成分和作用 GTE缓冲液： Tris-HCl溶液：调节pH。 葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。 EDTA：二价金属离子螯合剂，抑制DNase活性。 NaOH-SDS溶液： NaOH：溶解细胞，破坏核酸碱基配对使氢键断裂从而让核酸变性。 SDS：裂解细胞，结合蛋白质，形成SDS-蛋白质复合物。 乙酸钾溶液： 乙酸：中和NaOH，使质粒DNA复性为可溶性DNA。 钾离子：置换了SDS的钠离子形成不溶性的PDS，将基因组DNA和蛋白质沉淀下来。 RNase溶液：水解上清中小分子RNA。 异丙醇：快速沉淀质粒DNA，但难以挥发。 70%乙醇：去除异丙醇，且易于挥发除去。 TE缓冲液：溶解质粒DNA沉淀，含有EDTA能够使DNA保存时间更长。 具体步骤 取1.5ml对数生长期的菌体于Eppendorf管中，8000rpm离心1min，收集菌体。 弃上清液，将EP管倒置在吸水纸上，吸干溶液。 加入100ul GTE缓冲液，轻轻吹打重悬菌体，室温放置5min。 加入200ul新鲜配制的NaOH-SDS（100ul 2mol/L NaOH+100ul 10%SDS+800ul 双蒸水）溶液，颠倒混匀10次，冰浴5min。动作轻柔，同时控制好时间！ 加入150ul预冷的乙酸钾溶液，充分颠倒混匀，冰浴5min。一定要充分混匀！ 4℃，12000rpm离心5min，取上清300ul 转移至另一支新的EP管中。 加180ul异丙醇，冰浴20min，12000rpm离心5min，弃上清液。 缓慢加入70%乙醇0.5ml，轻轻上下颠倒， 12000rpm离心1min，吸弃大部分上清，挥干剩余乙醇。注意不要吹打沉淀！最后沉淀不要过于干燥！ 用20ul 含有RNase的TE溶液溶解沉淀的DNA，37 ℃ 水浴10min，4 ℃保存。 配制1%琼脂糖凝胶：1g琼脂糖粉末+100mlTAE缓冲液+5ul 10mg/ml EB。 上样6ul（5ul 质粒DNA+1ul 6×Loading Buffer），120V稳压电泳鉴定质粒DNA。 预期实验结果 质粒DNA在正常情况下以共价闭合环状cccDNA构型（超螺旋scDNA）存在，在提取过程中由于机械力、酸碱度等原因，可能会使DNA链发生断裂。 所以，多数质粒粗提物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）；开环DNA（ocDNA）；线性DNA（LDNA）。 注意事项 NaOH-SDS溶液处理时间不能太长，且不能激烈震荡，否则会断裂基因组DNA使之混入质粒DNA中。 加入预冷乙酸钾后要充分颠倒混匀，以中和NaOH，沉淀蛋白质和染色体DNA等。 70%乙醇洗涤时不要吹打质粒DNA沉淀，否则DNA会溶解在水中。同时DNA沉淀不能太过干燥，否则影响TE溶液溶解。 配制琼脂糖凝胶和电泳时，注意防护安全，不要将电泳使用过的手套带出电泳房。 课堂提问 NaOH-SDS溶液和乙酸钾溶液的成分、作用以及操作注意事项？ 质粒DNA的三种构型以及电泳条带分布？ 实验和作业要求 实验报告在下次实验课前由学习委员统一收齐上交。 实验报告：原理（不要照抄实验手册） 实验方法（可附加流程图） 结果（电泳鉴定需要附图） 讨论（实验失败要分析原因） * * 实验 一 染色体DNA 质粒DNA LDNA ocDNA cccDNA 电泳方向