分子生物实验课件：质粒DNA的提取、电泳.pptVIP

一、质粒DNA的提取 主要方法： 碱变性法 煮沸法 SDS法 羟基磷灰石层析法等 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。 4）加200μl新配制的溶液Ⅱ。盖紧管口，快速颠倒Ep管5次以混合内容物。轻微振荡，将Ep管放置于冰上5min。 5）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ。盖紧管口，温和颠倒数次使混匀，溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上5 min。 6）室温12 000rpm离心10min，取上清 转移到另一Ep管中。 7）加等量酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），振荡混匀，4℃12 000rpm离心5min，取上清 转移到另一Ep管中。 电泳步骤： 1.配胶：取1g琼脂糖放入100ml的1*TAE缓冲液中，加热2min使溶化，冷却至600C后加入EB （5 μl）至终浓度为0.5 μg/ml,混匀。 2.将凝胶趁热导入先前准备好的胶板中，达到3-5mm厚。冷却至完全凝固。 3.取胶放入电泳槽，将产物与6*Buffer 混匀后，进样。 4.上样端接负极，另一端接正极，开始电泳，25min. 5.取凝胶，观察。 * WenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院 WenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院 * WenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院 WenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院 * WenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院 WenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院 碱裂解法 基本原理： 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 主要试剂： 溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。 溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (临用前用10mol/L NaOH母液稀释)，1％ SDS。 溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。  质粒DNA小量提取步骤： 1）将1.5ml培养物倒入Ep管中，室温 10000rpm离心1min，将剩余的培养物贮存于4℃。 2）弃上清，使细胞沉淀尽可能干燥。 3）将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液Ｉ中，。须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散。 8）向上清液加入0.6倍体积异丙醇，混匀后，于-20 ℃放置30-60min. 9 ) 4℃12 000rpm离心10min。 10）弃上清，把Ep管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 11）用500μl 70%乙醇于4℃洗涤沉淀，12000rpm离心5min， 弃上清，在空气中使核酸沉淀干燥10 min。（可用吹风机吹干） 12）沉淀溶于30μl TE（含RNaseA20μg/ml），37℃水浴15min以降解RNA分子，-20℃保存备用。 1.提取过程中应尽量保持低温。 2.加入溶液II 和溶液III 后操作应混和,切忌剧烈振荡。 3.提取质粒DNA 过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。 注意事项： 二、电泳 实验原理： 溴化乙锭（EB）能够嵌入到DNA分子的碱基对中形成荧光复合物，在紫外线激发下发射荧光。 * WenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院 WenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院 * WenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院 WenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院 * WenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院 WenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院