分子生物学检验：真核细胞RNA提取及RT-PCR.pptVIP

真核细胞RNA提取及RT-PCR 1.RT-PCR反应体系 2.RT-PCR反应条件 第一步：50°C 30min 第二步：94°C 2min 第三步：94°C 30s 第四步：60°C 30s 第五步：72°C 30s 第六步：72°C 5min 第七步：4°C ∞ 2015.06.10 一、人骨髓细胞总RNA的提取（Trizol法提取） 目的： 1.掌握人骨髓细胞中总RNA提取的基本原理 2.熟悉Trizol法提取总RNA的原理和操作 原理: Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，再加入氯仿后形成两相，DNA与蛋白质存在于有机相，RNA保留于上层水相，将上层水样收集后，通过异丙醇沉淀即可得到RNA。 Trizol适用于从多种组织和细胞中快速分离总RNA 器材与试剂： EP管、加样枪、离心机、振荡器、Trizol Reagent 、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC(二乙基焦炭酸盐)水 标本：人骨髓液 操作步骤： 1．取骨髓液标本0.4ml，加0.8ml的Trizol，充分吹打混匀 2.各层相分离：室温静置5分钟，12000转/分，4℃离心10分钟，将上清液转移到另外一个EP管中 3．加入200ul氯仿，剧烈振荡混匀30s，静置3分钟，12000转/分，4℃，离心10分钟，离心后分三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相（RNA主要在水相中）和一个中间层。  4．将上清液小心转移到1.5ml离心管里，加入600ul异丙醇吹打混匀，室温下放置10min，12,000转，4 ℃离心10 min。 【注意：不要吸取任何中间层物质，否则会出现Genomic DNA污染】 5.小心移去上清液，防止沉淀丢失 6.用75%酒精（用DEPC水配置）洗涤，每次1ml，12000转/分，4℃，离心5分钟  7.尽可能彻底地吸走上清，同时防止丢失RNA沉淀 8.室温下干燥3-5分钟使酒精充分挥发，加20ul DEPC-H2O溶解，置冰上备用。  思考题： 1.哪些原因可导致RNA被降解？ 2.如RNA得率比较低，最可能出现的原因是什么？ 二、 RNA的琼脂糖电泳 【试剂准备】 所提取人骨髓细胞总RNA 10×Loading Buffer  Goldview 琼脂糖 TBE缓冲液 操作步骤： 1、用电子分析天平称取1.5g的琼脂糖放入三角烧瓶 2、将5×TBE用去离子水稀释到0.5×TBE工作液 3、用100ml量筒量取100ml 0.5×TBE到三角烧瓶中 4、将三角烧瓶的口用厚纸包严以防止挥发 5、将三角烧瓶放在微波炉中加热3～4分钟到完全融化 6、将三角烧瓶放置于室温冷却到不烫手 7、加入Goldview(EB替代品) 5μL摇匀，倒入制胶模具中 8、等琼脂糖完全凝固后拔去梳子，连塑料托底一起放入电泳槽中 9、取10μL所提取的人骨髓细胞总RNA，用2μL10×Loading Buffer混合后加入胶孔中 10、120V,电泳30min，用凝胶成像仪器成像 二、RT-PCR（逆转录聚合酶链反应） 目的： 1.掌握RT-PCR的基本原理； 2.熟悉RT-PCR的反应体系、操作及电泳分析 原理：提取组织或细胞中的RNA，采用oligo(DT)或随机引物，利用反转录酶反转录成CDNA，然后以CDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因的表达。 试剂：PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2（一步法试剂盒） 器材：凝胶电泳仪、PCR仪、凝胶成像仪、离心机、移液管、0.5×TBE、Goldview、DL2000 Marker、灭菌双蒸水 标本：人骨髓液 试剂 用量 终浓度 PrimeScript 1 step Enzyme Mix 2ul 2x1 step Buffer 25ul 上游primer（20uM） 1ul 0.4uM 下游primer（20uM） 1ul 0.4uM Template RNA 5ul RNase Free dH2O 16ul 30循环