分子生物实验课件：分子克隆实验（实验一、二、三）.pptVIP

重组子的筛选 （1）抗生素筛选法 pBR322质粒携带有氨苄青霉素和四环素抗性基因，可使接受了该质粒的受体菌具有了氨苄青霉素和四环素抗性，将经过转化后的受体细胞经过适当稀释，在含氨苄青霉素和四环素的平板培养基上培养，只有转化子才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素而无法存活。 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University （2）互补法 蓝白斑筛选（IPTG-Xgal）试验： 野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University 细菌染色体 含有lacZ基因C端序列 β-半乳糖苷酶缺陷型菌株 LacZ’基因 多克隆位点 β-半乳糖苷酶启动子 IPTG 非代谢性的乳糖启动子诱导剂 激活 载体 生成 含有X-gal和IPTG的培养基 有活性的 β-半乳糖苷酶 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University 细菌染色体 含有lacZ基因C端序列 有活性的 β-半乳糖苷酶 β-半乳糖苷酶缺陷型菌株 插入片段到多克隆位点 lacZ‘基因被破坏 载体 无法生成 含有X-gal和IPTG的培养基 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University 操作步骤 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University 1. 取菌液1.5ml于EP管中，冰上放置10 min；4℃，4000 rpm离心10 min，去上清，收集菌体。(从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳) 2. 用500 ml预冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴10 min。 3. 4℃，4000 rpm离心10 min，弃去上清液，加入50ml预冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，加入10 ml重组质粒DNA溶液，轻轻混匀，小心悬浮细胞后置于冰上30min。 4. 将上述混合物转移到42℃水浴锅中，热休克90s（不要摇动EP管！），然后将EP管迅速转移到冰上，冷却2-5min。 5. 向上述管中加入400 ml 的LB液体培养液，然后37℃，100 rpm，振荡培养约45-60 min. School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University 6. 取100 ml转化细胞至含有适当抗生素的LB平板上，用灭菌的玻璃棒（一定要冷却后再涂菌！）涂布均匀，室温放置待菌液完全被吸收后，倒置培养皿，37℃培养过夜。 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University 阳性克隆 阴性克隆 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University 《分子生物学检验技术》 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University * 分子克隆 * 分子克隆 分：分离目的DNA片段。（实验一） 切：限制酶切割目的基因与载体。（实验二） 接：拼接重组体。（实验二） 转：转入受体菌。（实验三） 筛：筛选重组体。（实验三） School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University 实验一 * 碱裂解法提取质粒DNA的分离和电泳鉴定 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University * School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法。 了解实验中所使用试剂的作用。 实验目的 * School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University 实验基本原理 染色体DNA 质粒DNA 碱裂解法是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到分离的目的。 * School of Laboratory Medicine, Wenzhou