分子生物实验课件：基因组DNA的提取、 LEPR基因的扩增(10-9).pptVIP

实验目的： 了解基因组DNA提取的方法、聚合酶链式反应的原理和操作方法。 实验原理： 煮沸法提取基因组DNA 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，英文缩写PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。 基因组DNA的提取、 LEPR基因的扩增 实验步骤： 一、基因组DNA提取 1.取含发囊的头发4-5根，用剪刀将发根部剪下约1cm左右放于1.5ml的 EP管中 或用棉签蘸取口腔的脱落细胞，放进装有1ml生理盐水的EP管中后离心收集细胞，弃上清。 2.消化液的配置(已经配好，放在实验室台面上)： 蛋白酶K 10ul TE缓冲液 1ml DTT 10ul 3.取50ul 消化液（TE） 加入上述离心后的EP管，重悬细胞。 4.先56度30min 然后 100度10min 5.10000rpm 3min，上清为下步PCR反应的模板 二、PCR扩增LEPR基因 30ulPCR体系： ddH2O： 19.8ul Buffer: 3.0ul dNTP: 1.0ul 引物： 1.0ul Ex taq: 0.2ul 模板： 5.0ul 注意：1.样品多时可配置总反应体系，然后分装25ul的PCR反应体系于PCR 反应管中，再加入5ul的上步上清液作为模板 2.注意混匀和离心 PCR扩增条件： 94° 2min 94° 30s 56° 30s 72° 40s 72° 10min 35个循环 PCR产物电泳观察： 1.配置琼脂糖凝胶：称取琼脂糖粉末1.0g，再量取1×TAE缓冲液100ml，将二者放入锥形瓶中，在微波炉里加热使琼脂糖溶化，然后用流水冷却至60度加入10ul Gelred染料，混匀，倒入两块平板中，直至凝固为止。 2.样品准备：PCR扩增产物 5ul 6×Loading Buffer 1ul 3.电泳：将上步准备好的6ul混合液以及5ul DNA Marker加入到凝胶孔，120V电泳15min。 4.结果观察：将凝胶放在成像系统里成像