分子生物实验课件：分子实验.pptVIP

酶切反应体系（20 ml） 质粒DNA (sod-T vector) ：10 ml 10×M : 2 ml HindⅢ : 1 ml EcoRⅠ: 1 ml ddH2O : 6 ml 从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段 在酶切的过程中，除产生我们所需要的目的片段外，还会产生一些非目的片段，这些片段可能会对连接反应产生干扰，去除这些非目的片段的最好的方法就是进行琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收。 琼脂糖凝胶回收的原理 不同分子量的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳中泳动速度不一样而分离。 NaI存在条件下，加热至55℃，含有DNA片段的琼脂糖凝胶就会融化，然后可利用硅胶树脂吸附DNA分子，从而得到纯净的DNA片段。 琼脂糖凝胶回收的原理 硅胶树脂在酸性高盐离子浓度下可以高效专一的吸附DNA，通过离心可将DNA片段沉淀下来，在碱性低盐离子浓度下其与DNA的结合能力会急剧降低，如：使用弱碱溶液如TE(pH8.0)就可以从硅胶离心柱洗脱得到纯净的DNA片段。 步骤： 取一干净的1.5ml的EP管，称重，做好标记。 紫外下用干净的手术刀切下含有目的片段（600-700bp左右）的凝胶块，放入已称重的EP管中，再次称重。 按每100mg琼脂糖凝胶块：400 ml Binding Solution的量，添加Binding Solution至装有凝胶的离心管中。50-60℃放置5-10min融胶。期间可震荡混匀数次，使凝胶充分融解。 步骤： 4. 将上述混合液转移至Genclean柱中，室温放置2 min，6000rpm室温离心1 min。将离心下来的液体倒回Genclean柱中再重复离心一次以提高回收效率。 弃收集管中的废液。往Genclean柱中加入500 ml Wash Solution，12000rpm，1min，弃废液。 重复步骤5一次。 步骤 7. 将Genclean柱放回收集管中，12000 rpm 离心1 min，彻底去除Wash Solution。 8. 将Genclean柱放到一干净的1.5 ml的EP管中，加入30 ml Elution Buffer，37 ℃放置2 min，12000 rpm离心1 min。 9. 取5 ml目的DNA，加入1 ml 6×Loading Buffer，电泳鉴定。剩余目的DNA将用于后续实验或-20 ℃保存。 注意事项 溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故切胶时间尽量短。 切胶时，尽量沿目的片段边缘切下，使其所带的琼脂糖尽量少。这样琼脂糖不会影响后面的提纯。 将目的DNA吸附在Genclean柱上，要重复回收一次，以提高目的DNA的回收效率。 Wash Solution清洗Genclean柱两次后，要再离心一次，以去除残余的Wash Solution，避免影响后续TE洗脱目的DNA。 DNA的重组连接的原理 DNA重组连接是通过将已经切开的载体和外源DNA，通过DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸酯键，从而形成新的DNA。 本实验利用T4DNA连接酶，有Mg2+、ATP存在的连接反应体系中，将载体puc18与目的基因sod连接起来。 连接体系（10ul）： 目的基因（sod）：7ul 载体（puc18）： 1ul Buffer: 1ul T4DNA ligase: 0.5ul ddH2O: 0.5ul 冷CaCl2转化原理 受体细胞处于0℃、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀呈球形，细胞膜的通透性发生改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞，外源DNA吸附于细胞表面，经42 ℃短时间热击处理，促使细胞吸附DNA复合物。 进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 （2）互补法 蓝白斑筛选（IPTG-Xgal）试验： 野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。 细菌染色体 含有lacZ基因C端序列 β-半乳糖苷酶缺陷型菌株 LacZ’基因 多克隆位点 β-半乳糖苷酶启动子 IPTG 非代谢性的乳糖启动子诱导剂 激活 载体 生成 含有X-gal和IPTG的培养基 有活性的 β-半乳糖苷酶 School of Laboratory Medicine, Wenzhou M