临床生物化学：第24章 连续监测法测定酶活性浓度.pptVIP

第*页 Add Title Click to edit title style Click to edit title style Click to edit title style Click to edit title style Click to edit title style Click to edit title style 测定水解反应生成的酸 该方法简便快速，适用于急诊有机磷中毒的快速筛查，但准确度较差。 该法操作简单、快速，灵敏度高，但由于反应速率较快，容易超过线性范围而需要稀释 一、胆碱酯酶测定（cholinesterase，ChE） 乙酰胆碱为底物 人工合成底物 （一）方法概述 第*页 第*页 丁酰硫代胆碱被ChE水解，生成硫代胆碱和丁酸；所释放的硫代胆碱与二硫代硝基苯甲酸反应生成黄色的硝基苯甲酸衍生物，在405nm波长下检测吸光度变化的速率就可以检测ChE的活性。 （二）常用方法 第*页 第*页 乙酰、丙酰和丁酰硫代胆碱的碘盐均可作为底物，但最好用丙酰，因为血清胆碱酯酶对乙酰亲和力小，用丁酰作底物时空白比丙酰高而酶活性比丙酰低。丁酰硫代胆碱法简便、快速，易于自动化，但只能测定血清ChE，而不能测定红细胞AChE。样品应注意避免溶血干扰本反应。在酶反应过程中存在底物的自发水解问题，故应注意每批样品做试剂空白测定，初始吸光度应小于0.5。 （三）方法学评价 第*页 Add Title Click to edit title style Click to edit title style Click to edit title style Click to edit title style Click to edit title style Click to edit title style Badansky 法、King法和Aymstrong法、Roy单磷酸脂法、Ew-en与Spitzer改良Roy法、?-萘酚磷酸法等，都为终点法 以2-氯-4-硝基苯磷酸单钾盐为底物的连续监测法，反应速度快，灵敏度高，但是需加β-环糊精阻止底物水解，且易受黄疸干扰。 二、酸性磷酸酶测定（acid phosphatase，ACP） 比色法 连续监测法 （一）方法概述 第*页 第*页 ACP反应以α-萘基磷酸盐为底物，在pH4.5～6.0的条件下释放无机磷酸盐。产物α-萘酚则偶联有色的偶氮试剂如固红TR盐，通过在405nm处监测偶氮化合物生成的速率来测定ACP的活性。 （二）常用方法 第*页 * * * * * * * ALT测定方法根据测定产物的不同分为：测定谷氨酸和测定丙酮酸。测定谷氨酸以酶电极法作代表，因需特殊仪器不适合临床检验。测定丙酮酸的方法又可以分为三类：①以赖氏法为代表的定时法：因该显色反应特异性差，α-酮戊二酸干扰大，在试剂配方中2,4-二硝基苯肼和α-酮戊二酸的用量严重不足，造成准确度和精密度较差。②以IFCC推荐法为代表的连续监测法；③偶联丙酮酸氧化酶法：利用丙酮酸氧化酶氧化丙酮酸生成过氧化氢，过氧化氢与2,4,6-三溴-3-羟苯甲酸和氨基安替比林在过氧化物酶的作用下生成红色化合物；该方法呈色反应特异性差，容易受到溶血、黄疸和血清中氧化还原物质的干扰，但检测的灵敏度高，可使用96孔板分析，在血站的筛查中广泛使用。目前，国内外实验室多采用连续监测法进行测定。 * * * * * * * 测定肌酸激酶的方法大致可分为四大类，即比色法、连续监测法、荧光法和化学发光法。后两类方法因需特殊仪器未能应用于临床常规检测。由于以磷酸肌酸为底物的逆向反应速度快，约为正向反应速度的6倍，所以采用逆向反应进行测定较为普及，其中以连续监测法最为常用，有两种工具酶及指示酶参与反应。在比色法中，以磷酸肌酸和ADP为基质，酶促产生的肌酸和?-萘酚与双乙酰反应，生成红色化合物用于比色，但不能连续监测。另外，精氨酸、胍乙酸和肌酐同样与双乙酸及?-萘酚发生显色反应，使用时需要注意。CK测定参考方法是IFCC推荐法—酶偶联法，是目前最常用的方法。 * * 临床常规测定CK同工酶多用电泳和免疫抑制法，但是干扰比较大，现在推荐用免疫抑制法和酶动力学结合方法直接测定CK-MB。电泳法：pH8.6缓冲液，三种同工酶同时向阴极泳动，CK-MM最快，其次为CK-MB，CK-BB几乎原地不动；该方法准确性、精密度和灵敏度都较差，且费时，操作繁琐，电泳的高温也会使CK活性下降，同时不能为临床提供快速准确的结果。免疫抑制法：试剂中含有抗CK-M亚基的抗体，与标本中的CK-MM、CK-MB结合，使CK-MM 100%被抑制，CK-MB则有50%被抑制，若不考虑CK-BB的含量，抑制后的酶活性乘2就是原来CK-MB的酶活性。另外还有离子交换层析