临床免疫检验实验课件：HBsAg测定的方法学评价.pptVIP

HBsAg测定的方法学评价 问题 1 测定HBsAg的方法有哪些？ 问题 2 简述各测定方法的原理？ 讨 论 评价各测定方法的优缺点。 评价各测定方法的灵敏度与精密度。 几种常用的方法 化学发光免疫分析 酶联免疫吸附试验（ELISA） 斑点金免疫层析试验 一、 化学发光免疫分析 标记物：吖啶酯 固相载体：磁性微粒子 底物： Pre-trigger（双氧水）/trigger（氢氧化钠） 分离：磁石 方法学评价 定量试验 灵敏度高、特异性好，精密度高； 自动化程度高，快速、简便； 试剂有效期长、没有放射性污染； 仪器贵重，难于普及。 二、酶联免疫吸附试验（ELISA） 测定对象：抗原或抗体 ； 试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。 类型 ：双抗体夹心法 、双位点一步法 、间接法 、竞争法 、捕获法 。 双位点一步法 方法学评价 定性试验 操作简单、快速、灵敏度高、特异性强； 设备简单、无污染，易于普及； 精密度不如化学发光法，因此用于定量分析时要注意； 注意钩状效应（hook effect ）及标准化操作。 三、斑点金免疫层析试验 免疫层析试验原理示意图 试剂条上端（A）和下端（B）分别粘贴吸水材料，免疫金复合物干片粘贴在近下端（C）处，紧贴其上为硝酸纤维素膜条。硝酸纤维素膜条上有两个反应区域，测试区（T）包被有特异抗体，参照区（R）包被有羊抗兔IgG。 方法学评价 定性试验 操作简便、快速，操作人员不需技术培训，常用于“床边检验”； 试剂稳定、易于保存； 无需特殊仪器设备，可单人测定； 不能准确定量，灵敏度不及酶标法和发光法。 HBsAg测定（ELISA法） 原理：双位点一步法 试剂与材料： 包被板（每组8孔） 酶结合物 阴阳性对照 底物A、B液 标本1～3号 操作步骤 加样：分别加入1～3号标本各50ul（做双孔），在7、8孔位分别加入阴、阳性对照各一滴（ 50ul）。 加酶结合物：各孔加入酶结合物各一滴（ 50ul），混匀，置37℃水浴箱30分钟。 洗板：弃去，加洗涤液注满各孔，静置30秒，弃去，拍干，重复5次。 显色：分别加入底物A、B液各一滴，混匀，置37℃水浴箱10分钟。 结果判断：显示兰色的为阳性。 HBsAg测定（ 金免疫层析法） 原理：略 试剂与材料： 试剂条 标本1～3号 操作步骤 将试剂条B端吸水材料浸入标本中，待液体层析到A端吸水材料时，将试剂条取出，平放。 15min内，目测观察结果。 结果判断： 若出现两条红色条带，说明标本HBsAg阳性 若出现一条红色条带 R区出现，说明标本HBsAg阴性 T区出现，试剂条失效 * 磁性微粒直径2.8μm * * 当待测抗原浓度过高时，过量的抗原可分别同固相抗体和酶标抗体结合而抑制夹心复合物的形成，出现钩状效应，显色降低，严重时可出现假阴性结果。必要时可将标本经过适当稀释后重复测定。 * 1. 阴性对照OD平均值≤0.1且阳性对照OD平均值≥0.8时实验正常，否则为实验无效。 2. 临界值（cut off值）计算： 临界值（cut off值）=阴性对照平均OD值×2.1 (阴性对照OD均值小于或等于0.05时按0.05计算；大于0.05且小于0.1时，按实测数计算；大于或等于0.1时，此试验需重做。) 3．待检样品OD值≥临界值（cut off值）者，为HBsAg阳性。 待检样品OD值＜临界值（cut off值）者，为HBsAg阴性。 * 磁性微粒直径2.8μm * * 当待测抗原浓度过高时，过量的抗原可分别同固相抗体和酶标抗体结合而抑制夹心复合物的形成，出现钩状效应，显色降低，严重时可出现假阴性结果。必要时可将标本经过适当稀释后重复测定。 * 1. 阴性对照OD平均值≤0.1且阳性对照OD平均值≥0.8时实验正常，否则为实验无效。 2. 临界值（cut off值）计算： 临界值（cut off值）=阴性对照平均OD值×2.1 (阴性对照OD均值小于或等于0.05时按0.05计算；大于0.05且小于0.1时，按实测数计算；大于或等于0.1时，此试验需重做。) 3．待检样品OD值≥临界值（cut off值）者，为HBsAg阳性。 待检样品OD值＜临界值（cut off值）者，为HBsAg阴性。