临床免疫检验实验课件：循环免疫复合物的检测.pptVIP

循环免疫复合物的检测 前言 免疫复合物：抗原与其相应的抗体结合形成的复合物 ---组织中固定的免疫复合物（局部免疫复合物） ---血液中的循环免疫复合物（circulating immune complex，CIC） 根据形成免疫复合物的Ag-Ab是已知或未知的将CIC分为两大类： 特异性免疫复合物：如HBsAg-抗HBsAg，甲状腺球蛋白-抗甲状腺球蛋白形成的免疫复合物； 非特异性免疫复合物。 循环免疫复合物的检测技术分为抗原特异性和非抗原特异性两类。 大多数情况下，免疫复合物抗原性质不清或太复杂了，所以前者不常用；后者检测的是血清中CIC的总量，不考虑形成CIC的抗原特异性。 类别 原理 方法 敏感性 备注 物理法 分子大小 1.超速离心 － 适于研究 2.分子超滤 － 适于研究 3.凝胶过滤 30μg 适于研究 溶解度 1.PEG沉淀 20μg 粗定量,易推广 2.冷沉淀 － 定性,临床应用 补体法 固定补体, 结合C1q 抗补体试验 0.1μg 常用,特异性差 1.C1q凝胶沉淀试验 100μg 定性,不易普及 2.C1q偏离试验 4μg 不易普及 3.液相法 10μg 不易普及 4.固相法 1μg 不易普及 胶固素 胶固素结合试验 3μg 敏感,稳定 抗Ig法 结合RF 1.RF凝胶沉淀试验 100G 定性,不敏感 2.mRF固相抑制试验 1～20μg 不易普及 3.PRF凝集抑制试验 1～10μg 不易普及 结合Ig 抗抗体法 2～3μg 不易普及 细胞法 Fc受体 1.血小板凝集试验 1～4μg 需新鲜制备 2.ADCC抑制试验 5～10μg 细胞活性质控难 3.Mφ吞噬抑制试验 0.03μg 细胞活性质控难 补体受体 1.Raji细胞法 6μg 需维持细胞株 2.花环抑制试验 10μg 影响因素多 实验原理－PEG比浊法 PEG（聚乙二醇）是非离子型水溶性聚合物，有很强的亲水性，可以破坏溶液中蛋白质表面的水化层，使蛋白质沉淀，即使浓度很高也不会引起蛋白质变性。 不同浓度的PEG能选择性沉淀不同的蛋白质。用终浓度为30～40g/L的PEG 6000能选择性沉淀CIC。 循环免疫复合物与聚乙二醇作用，以浊度变化表现出来，可根据浊度的大小来反映免疫复合物的多少。浊度的大小用分光光度计测定。 主要试剂与器材 待测血清（已1：3稀释） 0.1mol/L pH8.4硼酸缓冲液（BBS）、41g/L PEG溶液 分光光度计、0.5cm比色杯、试管 实验步骤 按照表格加样，此时PEG最终浓度为37.3g/L。 加样后，充分混匀，置4℃ 1h，置室温10min。 用分光光度计在波长495nm下测两管的A值，以BBS调零。 结果记录和判断 记录对照管和测定管的A值 待测血清A值＝测定管A值－对照管A值 正常血清CIC的A值为0.043±0.02（X±SD）。 大于正常人A值两个标准差或更高者为CIC阳性。 注意事项 不同浓度的PEG可沉淀不同分子量的免疫复合物。20g/L PEG 可沉淀较大的CIC，40g/L PEG 则沉淀较小的CIC，但浓度大于50g/L PEG选择性沉淀CIC的特性即消失，可能导致假阳性。 温度变化对结果影响较大。4℃时CIC沉淀最佳，室温每升高1℃，A值下降0.2。 低密度脂蛋白、高γ球蛋白血症或脂肪含量过高均可使浊度增加，故应空腹采血。 样本陈旧或反复冻融等均可影响检测结果，故待测血清一定要新鲜，防止血清污染及聚合IgG形成。通常4℃冰箱保存不能超过3天，-20℃保存时间可适当延长。 应用与评价 CIC的检测对免疫复合物病（如血清病、SLE）是一种辅助诊断指标，对判断疾病活动和疗效有一定意义。 PEG比浊法检测CIC快速、简便，敏感度达20mg/L，但不能区分免疫复合物的大小，且重复性和特异性较差，一般可以用于CIC的筛选。 CIC检测方法较多，但实际工作中尚未建立公认有效的单一方法，且没有理想的标准品用于定量试验，最好采用多种方法同时进行，以增加结果的可靠性。 * CIC是指在体液中游离的抗原-抗体复合物，分子量约为1000kD * 循环免疫复合物的测定虽无特异性诊断意义，但对病情的活动性判断和指导治疗有一定价值 * 聚乙二醇是平均分子量在约200到至少6000的乙二醇高聚物的总 称。品种很多，例如聚乙二醇300(PEG300)、聚乙二醇600(PEG600)、聚乙二醇20 000(PEG20M)，PEG后面数字表示平均分子量。常用的除上述外，还有1000，1500，2000，4000，6000等。随着平均分子量的不 同，性质也有差异。无色无臭粘稠液体至蜡状固体。溶于水、乙醇和许多