临床免疫检验实验课件：IgG测定的方法学评价.pptVIP

IgG测定的方法学评价 IgG测定方法? 单向免疫扩散试验 免疫比浊法 一、单向免疫扩散试验的原理 利用可溶性抗原在含有相应抗体的凝胶中向周围自由扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀环，沉淀环直径的大小与孔中抗原的浓度成正相关，与一系列的标准品对照，即可计算出样品中待测抗原的含量。 主要试剂与器材 1、待测血清1和2 2、人IgG参考品（IgG含量11.43g/l，50ul） 3、羊抗人IgG诊断血清、1.5％琼脂、生理盐水 4、载玻片、打孔器、三角烧瓶、吸管等。 操作步骤 制板：10ml 1.5％琼脂+0.1ml抗IgG，颠倒混匀，浇板，待冷凝。 打孔：用打孔器打14个孔，孔径3mm，孔距10mm。 稀释IgG参考 加样：五个稀释度的IgG参考和两个待测血清，每个加两孔，每孔9μl。 温育：放在湿盒中，37℃，24h。 结果观察 现象：加样孔周围出现大小不同的沉淀环。 上排为5个不同浓度的参考品； 下排为待测血清，下排右2为异常病理血清 记录各沉淀环的直径。 制作标准曲线，求出待测浓度。以IgG标准品浓度的对数值为横坐标，以环的直径为纵坐标，制作标准曲线，从而计算出待测血清中IgG的浓度。 注意事项 浇板用的玻片要洁净 制备抗体琼脂板时，琼脂温度要严格控制，温度太低会导致琼脂凝固，太高将影响所加抗体的活性 抗体与琼脂要充分混匀，制板要均匀、平整、厚度一致，无气泡 加样孔中的琼脂应挑干净，且不可损坏孔的边缘，确保每孔的液面基本一致 加样时，不能将样品加到孔的外面 方法学评价 定量试验； 方法简便易行，但试验所需时间较长； 灵敏度低； 影响因素多，误差较大，重复性不好； 每批实验均应同步绘制标准曲线； 目前基本上已被自动化分析所替代。 单扩出现误差的原因 抗原或标准液溢出加样孔； 因抗体或抗原过量而致沉淀环过小或过大； 加样量不足或过多，或混有起泡； 加样孔破损，使沉淀环呈不规则状； 板浇注后保存时间长，引起板内水分蒸发或变形； 浇注琼脂时不在水平台面，使胶板厚薄不匀； 打孔后挑取琼脂时将胶板挑起，与玻璃板剥离，以致标本在孔底流溢； 扩散时湿盒不平，导致沉淀环不圆。 二、 免疫浊度测定的原理 利用可溶性抗原和相应抗体在液相中特异结合，在特殊的缓冲液中快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。 当反应液中保持抗体过量时，形成的复合物随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增加，与一系列浓度的标准品对照，即可计算出待测样品的含量。 抗原浓度 测定范围 抗体过剩 抗原过剩 沉淀物的量 免疫比浊法的发展 1959年，Schultze等建立了透射比浊法（turbidimetry）； 1967年，Ritchie等建立了散射比浊法（nephelometry）； 1977年，Sternberg建立了速率散射比浊法（rate nephelometry）。 散射比浊法 终点（定时）散射比浊法 在免疫反应完成后测定反应液的浊度，浊度的大小与抗原的量呈正相关 速率散射比浊法 连续动态地监测免疫反应的过程，在抗体过量的前提下，抗原抗体反应速率由慢→快→慢，即出现速率峰，该峰值高低与抗原浓度呈正相关。 方法学评价 标准曲线比较稳定； 检测时间短，易于自动化； 灵敏度高，定量准确，精密度高 无放射性核素污染； 具有抗原过量的自动监测功能，保证了结果的准确性。 但仪器和试剂价格比较贵，对抗体的质量要求很高。 IMMAGE全自动特定蛋白分析仪 * 成人IgG 7-16.6g/L * 扩散圈呈两重沉淀环的双环现象。这是由于出现了不同扩散率，但抗原性相同的两个组分（ γ重链病血清中出现的γ重链和正常IgG并存）。 * 若待测抗原的浓度过高，超出线性范围，则应稀释后重做 * 1.25mg/L * 经典的海德堡曲线理论 * 速率为单位时间内形成的免疫复合物的量（不是免疫复合物累积的量），20-25s这个单位时间内反应的速率达到高峰，即出现速率峰 * 1-2min即可完成一项检测 * 成人IgG 7-16.6g/L * 扩散圈呈两重沉淀环的双环现象。这是由于出现了不同扩散率，但抗原性相同的两个组分（ γ重链病血清中出现的γ重链和正常IgG并存）。 * 若待测抗原的浓度过高，超出线性范围，则应稀释后重做 * 1.25mg/L * 经典的海德堡曲线理论 * 速率为单位时间内形成的免疫复合物的量（不是免疫复合物累积的量），20-25s这个单位时间内反应的速率达到高峰，即出现速率峰 * 1-2min即可完成一项检测