临床免疫检验实验课件：IL-2的测定—酶联免疫吸附试验.pptVIP

实验课要求 预习 不迟到、早退、不旷课、有事请假 穿白大褂、注意自我防护 不喧哗，不做与实验无关的事 不要急于开始做实验 不要急于写实验报告 实验完成后，自己把桌面收拾干净 值日要求：擦桌子，拖地、擦黑板、倒垃圾、关灯和门窗（劳动委员负责安排和监督） 认真完成实验报告 实验报告的要求 题目、原理、主要试剂与器材、步骤、结果（现象）、结论、注意事项、讨论（心得体会） 班级、姓名、学号 由学习委员统一收齐，按学号从小到大顺序放好，在下一周上课时交 自己写、书写整齐 订成一本或每次分开 IL-2的测定—酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ，ELISA） 酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验为一种固相酶免疫测定技术 先将已知抗原或抗体包被于固相载体表面，与待检样品中的相应抗体或抗原发生反应，再加入酶标记抗体或抗原与免疫复合物结合，最后加入酶的作用底物，根据产物颜色的深浅或测定其A值，可进行定性或定量分析。 实验原理 双抗体夹心法（一步法） 在一定范围内，显色深浅与IL-2的含量成正相关 主要试剂和器材 待测标本1和2 ELISA试剂盒： IL-2标准品（0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0ng/ml）、聚苯乙烯微孔板、酶结合物、显色剂A、显色剂B、终止液、洗液 加样：将微孔板编号，按下表加样 加酶结合物：每孔50μl，轻轻摇动几下，37℃×30min。 洗涤：弃孔中液体，各孔加满洗涤液静置20s，弃之，反复5次，拍干。 显色：加入底物50μl，随即加入显色剂50μl，轻轻摇动几下， 37℃×10min 。 加终止液：每孔加50μl。 比色：用酶标仪读取OD值，波长为450nm。 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 加入物 (ng/ml) 0 2 5 10 20 40 待测1 待测2 加入量 (μl) 50 50 50 50 50 50 50 50 实验步骤 实验结果 结果记录：按下表记录结果 绘制标准曲线：以OD450值为横坐标，IL-2标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线。 求出待测标本1和2中IL-2的浓度。 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 加入物 (ng/ml) 0 2 5 10 20 40 待测1 待测1 OD450nm ? ? ? ? ? ? ? ? 标本1：4.5 ng/ml 标本2：25.5 ng/ml 注意事项 试剂盒从冰箱中取出后，室温平衡30min左右再开启使用 。 加样时每一步要一个人完成，要加到微孔的底部，加样量要准确。 标准品从低到高的顺序加，加完之后切勿盖错盖子 。 洗涤要严格按照要求，彻底洗涤，防止假阳性，但不可冲洗过猛过急导致假阴性。 严格控制反应时间和显色时间。 应用与评价 IL-2最主要的生物活性是刺激T细胞的增殖，因此IL-2的测定对机体的免疫功能有一定的监测作用。 用该方法检测IL-2的优缺点 优点 特异性强，这是标记免疫技术的共同特点。 使用简便，省时。 重复性好，影响因素少，实验结果稳定。 缺点 测定的是蛋白含量而不是生物学活性。 检测的灵敏度不如生物学活性法。 * 聚苯乙烯制成的微量反应板 * 聚苯乙烯，辣根过氧化物酶，四甲基联苯胺（TMB）和过氧化氢，稀盐酸或稀硫酸 * N.S作为0浓度，酶标仪是空气调零，无需作空白孔。 对TMB显色剂，如果用双波长，一般用450和630这两个波长，450是主波长，630是本底，检测结果是主波长的值减去本底值 * IL-2最主要的生物活性是刺激T细胞的增殖，曾被称为T细胞生长因子。 * 聚苯乙烯制成的微量反应板 * 聚苯乙烯，辣根过氧化物酶，四甲基联苯胺（TMB）和过氧化氢，稀盐酸或稀硫酸 * N.S作为0浓度，酶标仪是空气调零，无需作空白孔。 对TMB显色剂，如果用双波长，一般用450和630这两个波长，450是主波长，630是本底，检测结果是主波长的值减去本底值 * IL-2最主要的生物活性是刺激T细胞的增殖，曾被称为T细胞生长因子。