临床生物化学：第30章 层析法测定生化物质.pptVIP

第*页 第*页 二、骨型碱性磷酸酶测定 4．电泳法 有亲和电泳法和琼脂凝胶电泳等。亲和电泳是利用麦胚凝集素(WGA)特异地与B-ALP结合形成WGA-B-ALP复合物,该复合物在电场中不泳动或泳动很慢,从而将骨、肝型ALP清楚地分开。 5.其他方法 热失活法和化学抑制法，方法灵敏度和特异性较差，目前只用作鉴别某些病理血清中ALP组织来源的过筛试验。 第*页 第*页 第*页 （二）麦芽凝集素亲和层析法原理 采用麦芽凝集素亲和层析与HPLC结合测定B-ALP。麦胚植物凝集素(wheataaglgglutinator，WGA)是凝集素中的一种，在中性环境中可形成二聚体，每个多肽链都有两个N－己酰氨基葡萄糖结合位点。因此每个二聚体有4个结合位点，亲和力大。WGA特异地与B-ALP结合形成WGA-B-ALP复合物，经层析作用是将B-ALP和其他组织来源的ALP分开，用HPLC测定。 第*页 第*页 1．凝集素是一种糖结合蛋白，能凝集细胞或使复合糖沉淀。 每种凝集素能特异地与某一糖序列结合。 WGA与ALP结合的机理仍不够清楚,可能与糖链末端存在成簇唾液酸残基有关。 2．WGA亲和层析法是麦胚凝集素与HPLC法结合测定B-ALP，方法稳定、重复性好、精密度高、结果可靠。 第*页 （二）麦胚凝集素亲和层析法性能评价 * * 1952年真的有应用 * * 正相层析流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。反相层析流出顺序极性大的先流出，极性小的后流出，与正相正好相反。 反相层析最为常用，优点： 反相层析用流动相的价格比正相层析便宜 对操作环境的污染较小 非极性固定相表面的作用力弱，故色谱柱达到平衡比较快 梯度洗脱的柱子更易于“再生” * * 氨基酸检测方法主要有定性试验和定量试验。特异性强灵敏度高的酶法及HPLC * * 大多数氨基酸无紫外吸收及和荧光发射特征，在HPLC前先标记产生荧光或紫外有较强吸收的化学物质。 * * GHb：红细胞中Hb与葡萄糖持续且不可逆地进行非酶促蛋白糖基化反应的产物。与红细胞寿命和该时期内血糖平均浓度有关，而不受每天葡萄糖波动的影响，也不受运动或食物的影响。反映8-10周内平均血糖浓度。是糖尿病血糖控制的金标准。 * * 手工微柱法：最初建立的实验室方法，因操作方法和微柱的质量不易控制,易产生误差。 全自动离子交换高效液相色谱(HPLC)法：能分离HbA1a、HbA1b和HbA1c和HbA0，并在临床上应用已较成熟。因此，美国、瑞典及日本等国家将其作为HbA1c标准化参考系统的参考方法。 * * 高效是通过高压系统来实现，市场上也有低压系统，但精密度不及HPLC法。变异系数CV在3%以内。因此美国、瑞典及日本等国家将其作为HbA1c标准化参考系统的参考方法。 * * 该方法测定的是GHb%，而不是HbA1c的含量。 * * 精密度和稳定性取决于所采用的技术。 * * HbA1c前体（Schiff碱）、胎儿血红蛋白( HbF)、衍生血红蛋白（甲酰化或乙酰化血红蛋白）及变异血红蛋白（HbS、HbC、HbE和HbD）等因素的干扰。 * * HbA1c是反映过去8～10周平均血糖水平的指标，在临床上作为评估长期血糖控制状况的金标准，也是临床决定是否需要调整治疗的重要依据。以HbA1c为目标的强化血糖控制可降低糖尿病微血管及大血管并发症的发生风险。 * * 薄层色谱法虽然不断改进点样定量技术并用扫描定量，但其灵敏度和重复性仍差，除用于毒物的定性检测外，在TDM中极少应用。 气相色谱法及高效液相色谱法:共同的特点是分离度好、专属性强，可以同时测定几种药物。 高效液相色谱法应用最广，美国的药典规定大部分药物的标准检测法为高效液相色谱法，并常用作评估其他方法的参考方法。 HPLC-质谱联用(HPLC-tandem mass spectrometers, LC-MS)，更进一步提高了特异性和灵敏性，分离性能好,在检测药物的代谢物有其独特的优点。兴奋剂的检测，则要求必须用HPLC-MC法。本法缺点是仪器昂贵,技术要求高，测定费时，其专用性强，一台仪器在同一时间内只能测定一种或一类药物,需要相当长时间的训练, 需复杂的样本预处理, 限制了其推广普及。 * * 不少药物都是半抗原或抗原，可制备药物相应的特异性抗体，用免疫化学方法对其进行检测。免疫化学方法灵敏度高，可达ng甚至pg水平，可满足所有药物TDM的要求。其优点是灵敏度高，取样少，操作简单，样本不需要进行预处理。放射免疫法同位素污染，需有防护设备，由于衰变和辐射自分解导致标记物有效使用时间缩短，该法极少采用。 酶免疫法，成本低，测定快速,几十分钟多至几小时能完成一个样品测定,但灵敏度较差,极少药物采用此法测定。化学发光技术、荧