临床生物化学检验实验：实验八 GLU测定及其酶试剂用量的影响2.pptVIP

第*页 实验八 GLU测定及其酶试剂用量的影响 第*页 1.掌握GOD-POD法测定葡萄糖的原理和方法 2.了解酶试剂用量和反应温度对测定结果的影响 实验目的 概述 葡萄糖测定的方法很多，迄今为止大体可分为三大类：化学法、酶法和其它方法。 化学法有氧化还原法（Folin-Wu法）、缩合反应法（邻甲苯胺法） 酶法有己糖激酶法（参考方法）和葡萄糖氧化酶法（推荐常规方法）. 实验原理 GOD-POD法测葡萄糖原理 GOD 葡萄糖+O2+H2O 葡萄糖酸+H2O2 POD H2O2+酚+4-AAP H2O+醌亚胺（红色） （Trinder反应） 在500nm波长下测吸光度，吸光度大小与葡 萄糖浓度成正比。 试剂与器材 1、试剂组成：试剂组成：R1：苯酚10mmol/L，POD1000U/L，抗VIC氧化酶； R2： GOD1600U/L, 4-AAP2mmol/L 2、试剂包装：缓冲液90ml×2，酶溶液10ml×2，标 准液浓度5.56 mmol/L 3、工作试剂配制：本试剂盒为液态双试剂，加双试剂的仪器 可直接应用，试剂更稳定，加单一试剂的仪器临用时缓冲 液和酶溶液以3：1的比例混合。 操作(一)、手工操作：标本常规测定（表1） 加入物(ml) U（血清） S B 血清 0.03 标准液 0.03 蒸馏水 0.03 工作液 3.0 3.0 3.0 混匀，置37℃水浴10分钟，500nm波长，1.0cm比色杯，空白管调零，读取测定管和标准管的吸光度值（A)。 * 1、表1【反应时间进程曲线】（表1）（事先预热比色计） 加入物(ml) U（血清） S B 血清 0.03 标准液 0.03 蒸馏水 0.03 工作液 3.0 3.0 3.0 立即混匀 室温反应 2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20 min 在波长500nm处以空白管调零，读取各管吸光 度。 先加好“蒸馏水”“血清”“标准液”，调好比色计，然后再加“工作试剂”… 掌握好时间，按照不同时间比色，记录各管吸光度，用各个时间点在方格纸上描曲线（y吸光度，x时间0～20min）观察温度与反应进程的关系。 2、【观察减少酶用量后反应到达终点时间变化曲线】： 将上述工作液稀释（取19ml R1试剂＋R2试剂 1ml）混合成稀释工作试剂。 取同一份血清，按表1步骤操作，混匀，立即倒入1.0cm比色皿，室温条件下，测定5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 min分钟时的测定管吸光度，把这6个吸光度描在上述方格纸上，绘制时间进程曲线，与“1”项中绘制的时间进程曲线比较。 * 2、（表2观察减少酶用量后反应到达终点时间变化曲线）（事先预热比色计） 加入物(ml) U（血清） S B 血清 0.03 标准液 0.03 蒸馏水 0.03 稀释工作液 3.0 3.0 3.0 立即混匀 室温反应 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 min 在波长500nm处以空白管调零，读取各管吸光 度。 实验报告要求：结论 1.以实验（1）结果分别说明反应温度、时间的改变对测定结果的影响；2.以实验（2）结果与实验（1）进行比较，说明酶量不足的情况下反应进程有何改变？3.计算待测标本的结果。 （二）自动生化仪分析测定 参数设置：标本3ul，试剂300ul（混合工作液，单试剂） 标本试剂体积比1:100，波长500nm，温度37℃，反应时间5分钟，终点法 参考范围空腹血清葡萄糖3. 9-6.1mmol/L（70-110mg/dl） 糖尿病的诊断标准空腹血糖FPG≥7.0mmol/L，餐后2小时PBG≥11.1mmol/L 注意事项 1、葡萄糖氧化酶对β-D葡萄糖高度特异。新配制的葡萄糖标准主要是α型，故须放置2小时以上（最好过夜），待变旋平衡后方可使用。 2、过氧化物酶的特异性