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第*页 实验 二 乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯 郑佳音 第*页 实验目的 掌握:掌握乙酰丙酮显色法测定TG的原理 熟悉: 抽提法抽提TG的多步骤操作过程 第*页 【血浆脂蛋白结构】 第*页 【血清TG测定方法概述】 化学法用有机溶剂抽提标本中的TG,去除标本中的磷脂等干扰物后,用碱水解(皂化)TG为甘油,以过碘酸氧化甘油生成甲醛,然后用显色反应测定甲醛。其中比较准确的是变色酸显色法(Van-Handel法),比较简便的是乙酰丙酮显色法。 酶法始于20世纪70年代初,80年代开始普及全酶法。曾经应用过偶联丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶的紫外分光光度法,甘油脱氢酶法,磷酸甘油氧化酶法,甘油磷酸脱氢酶法等多种。以GPO-PAP法较为常用 。 第*页 化学法基本步骤: 1.抽提 抽提的关键是选用合适的抽提剂,既要使甘油三酯提取完全,又要消除磷脂、游离甘油和葡萄糖等干扰物质的影响。 用正壬烷、异丙醇和稀硫酸混合溶剂选择性提取甘油三酯。抽提后,下层异丙醇中主要是化学极性大的磷脂和游离甘油,上层正壬烷中主要是甘油三酯,约占总量的99%。正壬烷可以用正庚烷代替。 第*页 化学法基本步骤: 2.皂化 甘油三酯水解生成甘油,这一步大都采用KOH作皂化剂,温度一般控制在50~60℃,时间为5~15min。水解不完会影响测定结果。 3.氧化 过碘酸在酸性溶液中将甘油氧化成甲醛和甲酸。由于这一反应并非甘油特有,凡含有相邻的羟基或有相邻的羟基和氨基的化合物,如α-磷酸甘油(磷脂的水解产物)、葡萄糖等都会引起干扰,故在第一步提取时应尽量除去这类物质。 4. 显色 ①甲醛与变色酸在硫酸溶液中加热生成紫色化合物,吸收峰为570nm。该法灵敏度高,也较稳定,线性范围可达10mmol/L; 第*页 化学法基本步骤: ②甲醛与乙酰丙酮在铵离子(NH4+)存在下生成黄色的二乙酰二氢二甲基吡啶,吸收峰为412nm。(亦可用荧光法测定。) 第*页 【方法学评价】 目前TG测定尚无公认的参考方法,美国CDC将Van-Handel方法修改后作为内部参考方法。此法抽提完全,去除了磷脂与甘油干扰,以变色酸作显色剂,具有灵敏度高,呈色稳定等优点,但操作步骤多,不适合于日常工作中应用。 化学法中比较简便且准确度高的方法是用异丙醇抽提,沸石合剂吸附磷脂,经皂化与氧化后用乙酰丙酮显色的修改LRC法。 第*页 【实验原理】 血清甘油三酯(triglyceride,TG)经正庚烷-异丙醇抽提,然后用氢氧化钾皂化,所生成的甘油再被过碘酸钠氧化为甲醛,后者在铵离子存在下与乙酰丙酮反应,生成带荧光的黄色物质即3,5-二乙酰-1,4-二氢二甲基吡啶(Hantgsch反应),颜色深浅与血清甘油三酯浓度成正比。与同样处理的标准液比较,求得其含量。 第*页 抽提剂:正庚烷与异丙醇以2:3.5体积混合,贮棕色瓶中. 0.04mol/L硫酸: 皂化剂:取KOH(AR)2.5g,加50ml蒸馏水溶解,加异丙醇500ml, 贮棕色瓶中 氧化剂:无水醋酸铵77g溶于蒸馏水中,加冰乙酸60ml,过碘酸1g,加蒸馏水至1升 显色剂:乙酰丙酮2ml加至异丙醇500ml,混匀,贮于棕色瓶内. 甘油三酯校准品:1.15mmol/L 【试剂与器材】 第*页 表2-3 乙酰丙酮显色法测定甘油三酯 加入物(ml) 空白管 标准管×2 测定管×2 血清 - - 0.2 标准液 - 0.2 - 蒸馏水 0.2 - - 抽提剂 2.5 2.5 2.5 40mmol/L H2SO4 0.4 0.4 0.4 边加边摇,使之充分混匀,静置分层后,分别准确吸取上清液于另外3支试管中 上清液 0.3 0.3 0.3 皂化剂 1.0 1.0 1.0 充分混匀,65℃水浴3min 氧化剂 1.0 1.0 1.
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