临床生物化学检验实验：实验五 碱性磷酸酶测定2015.pptVIP

全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定酶活性 实验5 原子吸收光谱法测定血清铜、锌 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 单击此处编辑母版标题样式 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 单击此处编辑母版标题样式 * 实 验 五 血清碱性磷酸酶测定及线性期观察 * 实验目的 掌握： 色素原底物测定ALP的原理和优点 熟悉： 熟悉定时法和连续监测法测定酶活性不同 摩尔吸光系数的测定方法 测定ALP的临床意义 了解： 定时法的线性观察 * 血清碱性磷酸酶测定 一、概述 ALP为碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）是一组底物特异性较低，在碱性条件下能水解磷酸单酯化合物的酶。需要镁和锰离子为激活剂。广泛分布于机体各器官组织，在肝、肾、胎盘、小肠、骨骼等组织含量较高。血清中的ALP主要来源于肝脏，小部分来源于骨骼。 * 碱性磷酸酶同工酶分为四型：肠型（IAP）、生殖细胞型（GCAP）、胎盘型（PALP）和非特异组织型（TUAP）。 ALP确切的生理作用目前仍不十分清楚，一般认为骨中ALP和骨的钙化作用密切相关，成骨细胞中的ALP作用产生磷酸，与钙生成磷酸钙沉积于骨中。ALP还广泛存在于肝细胞血窦侧和胆小管膜上、肾近侧曲管刷状缘和小肠粘膜的微绒毛，据此推测它可能还与物质的吸收和运转过程有关。 * ALP变化与年龄密切相关，新生儿ALP略高于成年人，以后逐渐增高，在1-5岁有一次高峰，可达成年人上限2.5-5倍，以后下降，到儿童身长增高期又再次上升，第二高峰在10-15岁之间，可达成人上限4-5倍。20岁后降至成年人值，到老年期又轻度升高。 孕妇血清ALP在妊娠3个月即开始升高，9个月可达峰值，约为正常值的2倍，ALP升高可维持到分娩后1个月，升高的ALP来自胎盘，和胚泡壁的细胞滋养层的发育程度直接相关。高脂餐后，血清ALP活性升高。 * 二、测定方法 因底物不同，测定方法很多。具有代表性的方法有： （1）以布氏（Bodansky）法为代表：β-甘油磷酸钠做底物经ALP作用后产生磷酸根，通过定量磷来测定。 （2）以金-阿（King-Armstrong）法为代表：磷酸苯二钠做底物经ALP作用后产生酚，通过定量酚来测定。 （3）以皮-劳（Bessey-Lowery-Brock）法为代表：人工合成底物磷酸对硝基酚二钠盐（PNPP）做底物，经ALP作用后产生对硝基酚在碱性的测定条件下呈黄色而可以连续监测。 * 实验原理 PNP在碱性环境下呈黄色（405nm），在400－410nm处 监测吸光度变化速率，来计算ALP活性。 AMP: 2-甲基-2-氨基-1丙醇 定时法：用氢氧化钠终止反应。 连续监测法：利用连续监测吸光度增高速率（△A/min）与ALP活性成正比。求出ALP的活性。（自动化分析） ALP测定的反应式为： * 试剂与器材 1.试剂组成 （1）试剂Ⅰ（R1）： 2-甲基-2-氨基-1丙醇 （AMP） 缓冲液1.00mol/L、 MgCl2 0.5mmol/L （2）试剂Ⅱ（R2）：4-NPP 100mmol/L、MgCl2 0.5mmol/L （3）4-NP标准品：2mmol/L （4）0.2mol/LNaOH 若作单试剂法，可将试剂Ⅰ4份与试剂Ⅱ1份临用前混合成工作液。 2.生化分析仪测定条件 温度37±0.1℃；光径1.0±0.01mm；波长405±1nm；带宽≤2nm。 * 1、标本检测：在测定前取适量的底物溶液和待测血清，37℃水浴预温5min后使用；具体操作按下表进行。 加入物(ml) 测定管（1号血清） 标准管 空白管 血清 0.02 标准液 0.02 蒸馏水 0.02 基质缓冲液 2.0 2.0 2.0 混匀后，置37℃准确保温10min 0.2molNaOH 2.0 2.0 2.0 室温放置5min，在波长405nm处以空白管调零，读取各管吸光 度。 手工操作步骤 * 2、反应线性期观察 加入物(ml) U1～U6（2号血清） S B 血清 0.02 标准液 0.02 蒸馏水 0.02 基质缓冲液 2.0 2.0 2.0 37℃保温 2.5、5、7.5、 10、12.5、15 min